A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירה וניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וגרעין יחיד.
במהלך העשור האחרון, שעתוק חד-תאי התפתח באופן משמעותי והפך לשיטת מעבדה סטנדרטית לניתוח סימולטני של פרופילי ביטוי גנים של תאים בודדים, המאפשר ללכוד את המגוון התאי. על מנת להתגבר על המגבלות שמציבים סוגי תאים קשים לבידוד, ניתן להשתמש בגישה חלופית שמטרתה לשחזר גרעינים בודדים במקום תאים שלמים לריצוף, מה שהופך את פרופיל השעתוק של תאים בודדים ליישום אוניברסלי. טכניקות אלה הפכו לאבן פינה בחקר אורגנואידים במוח, וביססו אותם כמודלים של המוח האנושי המתפתח. תוך מינוף הפוטנציאל של שעתוק חד-תאי וחד-גרעין במחקר אורגנואידים במוח, פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב המקיף הליכים מרכזיים כגון דיסוציאציה אורגנואידית, בידוד תא בודד או גרעינים, הכנת ספרייה וריצוף. על ידי יישום גישות חלופיות אלה, חוקרים יכולים להשיג מערכי נתונים באיכות גבוהה, המאפשרים זיהוי של סוגי תאים עצביים ולא עצביים, פרופילי ביטוי גנים ומסלולי שושלת תאים. זה מאפשר חקירות מקיפות של תהליכים תאיים ומנגנונים מולקולריים המעצבים את התפתחות המוח.
במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות אורגנואידים התגלו ככלי מבטיח לתרבית רקמות דמויות איברים 1,2,3. במיוחד עבור איברים שלא ניתן לגשת אליהם בקלות, כגון המוח האנושי, אורגנואידים מציעים הזדמנות לקבל תובנות לגבי התפתחות וביטוי מחלות4. ככאלה, אורגנואידים במוח נמצאים בשימוש נרחב כמודל ניסיוני לחקר הפרעות מוח אנושיות שונות, כולל מחלות התפתחותיות, פסיכיאטריות או אפילו נוירודגנרטיביות 4,5,6.
עם הופעתן של טכנולוגיות פרופיל שעתוק חד-תאי, רקמות אנו....
הפרוטוקול המתואר מבוצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 1 של מרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית (מספר אישור: 138/08), בהתאם לדרישות ובהתאם לכללי האתיקה של האיחוד האירופי והמדינה במחקר.
1. גזירה של אורגנואידים במוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)
הערה: פ.......
כדי לחקור את הרכב סוג התא של אורגנואידים במוח באמצעות scRNA-seq ו-snRNA-seq, אורגנואידים במוח נקצרו לאחר 30 יום של תרבית, שכן אורגנואידים בשלב זה כבר מציגים לולאות נוירואפיתליאליות המורכבות מאבות מוקפים באבות ביניים ונוירונים בשלב מוקדם 4,18. ניטור איכות האורגנואידים.......
ניתוח שעתוק של תאים בודדים וגרעינים בודדים התגלה ככלי מרכזי להבנת מנגנוני בקרת גנים בתוך רקמות מורכבות. שתי השיטות מאפשרות מחקרי שעתוק של אורגנואידים במוח. כדי להבטיח ניסוי מוצלח כולל, איכות חומר המוצא היא בעלת רלוונטיות גבוהה. לכן, יש צורך לחתוך את האורגנואידים באופן קבוע כדי למנוע היווצ.......
אנו מודים לולריה פרננדז-ואלון על ההוראות המקוריות לערכת הדיסוציאציה העצבית של Miltenyi. אנו מודים גם לפלטפורמת הטכנולוגיה הגנומית של מרכז מקס דלברוק על שסיפקה את המתכון למאגר הליזיס NP40 ועל העצות החשובות להגדרת פרוטוקול זה. אנו מודים גם למרגרטה הרצוג ולאלכסנדרה צ'רנישף על התמיכה הארגונית במעבדה.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
cAMP | Biogems | 6099240 | |
cAMP | Biogems | 6099240 | |
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
PenStrep (Penicillin - Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved