Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירה וניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וגרעין יחיד.

Abstract

במהלך העשור האחרון, שעתוק חד-תאי התפתח באופן משמעותי והפך לשיטת מעבדה סטנדרטית לניתוח סימולטני של פרופילי ביטוי גנים של תאים בודדים, המאפשר ללכוד את המגוון התאי. על מנת להתגבר על המגבלות שמציבים סוגי תאים קשים לבידוד, ניתן להשתמש בגישה חלופית שמטרתה לשחזר גרעינים בודדים במקום תאים שלמים לריצוף, מה שהופך את פרופיל השעתוק של תאים בודדים ליישום אוניברסלי. טכניקות אלה הפכו לאבן פינה בחקר אורגנואידים במוח, וביססו אותם כמודלים של המוח האנושי המתפתח. תוך מינוף הפוטנציאל של שעתוק חד-תאי וחד-גרעין במחקר אורגנואידים במוח, פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב המקיף הליכים מרכזיים כגון דיסוציאציה אורגנואידית, בידוד תא בודד או גרעינים, הכנת ספרייה וריצוף. על ידי יישום גישות חלופיות אלה, חוקרים יכולים להשיג מערכי נתונים באיכות גבוהה, המאפשרים זיהוי של סוגי תאים עצביים ולא עצביים, פרופילי ביטוי גנים ומסלולי שושלת תאים. זה מאפשר חקירות מקיפות של תהליכים תאיים ומנגנונים מולקולריים המעצבים את התפתחות המוח.

Introduction

במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות אורגנואידים התגלו ככלי מבטיח לתרבית רקמות דמויות איברים 1,2,3. במיוחד עבור איברים שלא ניתן לגשת אליהם בקלות, כגון המוח האנושי, אורגנואידים מציעים הזדמנות לקבל תובנות לגבי התפתחות וביטוי מחלות4. ככאלה, אורגנואידים במוח נמצאים בשימוש נרחב כמודל ניסיוני לחקר הפרעות מוח אנושיות שונות, כולל מחלות התפתחותיות, פסיכיאטריות או אפילו נוירודגנרטיביות 4,5,6.

עם הופעתן של טכנולוגיות פרופיל שעתוק חד-תאי, רקמות אנו....

Protocol

הפרוטוקול המתואר מבוצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 1 של מרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית (מספר אישור: 138/08), בהתאם לדרישות ובהתאם לכללי האתיקה של האיחוד האירופי והמדינה במחקר.

1. גזירה של אורגנואידים במוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)

הערה: פ.......

Representative Results

כדי לחקור את הרכב סוג התא של אורגנואידים במוח באמצעות scRNA-seq ו-snRNA-seq, אורגנואידים במוח נקצרו לאחר 30 יום של תרבית, שכן אורגנואידים בשלב זה כבר מציגים לולאות נוירואפיתליאליות המורכבות מאבות מוקפים באבות ביניים ונוירונים בשלב מוקדם 4,18. ניטור איכות האורגנואידים.......

Discussion

ניתוח שעתוק של תאים בודדים וגרעינים בודדים התגלה ככלי מרכזי להבנת מנגנוני בקרת גנים בתוך רקמות מורכבות. שתי השיטות מאפשרות מחקרי שעתוק של אורגנואידים במוח. כדי להבטיח ניסוי מוצלח כולל, איכות חומר המוצא היא בעלת רלוונטיות גבוהה. לכן, יש צורך לחתוך את האורגנואידים באופן קבוע כדי למנוע היווצ.......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

Acknowledgements

אנו מודים לולריה פרננדז-ואלון על ההוראות המקוריות לערכת הדיסוציאציה העצבית של Miltenyi. אנו מודים גם לפלטפורמת הטכנולוגיה הגנומית של מרכז מקס דלברוק על שסיפקה את המתכון למאגר הליזיס NP40 ועל העצות החשובות להגדרת פרוטוקול זה. אנו מודים גם למרגרטה הרצוג ולאלכסנדרה צ'רנישף על התמיכה הארגונית במעבדה.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

References

  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved