יצירה וניתוח במורד הזרם של תעתיקים חד-תאיים וגרעינים בודדים באורגנואידים במוח

Summary

כאן, אנו מציגים פרוטוקול מקיף ליצירה וניתוח במורד הזרם של אורגנואידים במוח האנושי באמצעות ריצוף RNA חד-תאי וגרעין יחיד.

Abstract

במהלך העשור האחרון, שעתוק חד-תאי התפתח באופן משמעותי והפך לשיטת מעבדה סטנדרטית לניתוח סימולטני של פרופילי ביטוי גנים של תאים בודדים, המאפשר ללכוד את המגוון התאי. על מנת להתגבר על המגבלות שמציבים סוגי תאים קשים לבידוד, ניתן להשתמש בגישה חלופית שמטרתה לשחזר גרעינים בודדים במקום תאים שלמים לריצוף, מה שהופך את פרופיל השעתוק של תאים בודדים ליישום אוניברסלי. טכניקות אלה הפכו לאבן פינה בחקר אורגנואידים במוח, וביססו אותם כמודלים של המוח האנושי המתפתח. תוך מינוף הפוטנציאל של שעתוק חד-תאי וחד-גרעין במחקר אורגנואידים במוח, פרוטוקול זה מציג מדריך שלב אחר שלב המקיף הליכים מרכזיים כגון דיסוציאציה אורגנואידית, בידוד תא בודד או גרעינים, הכנת ספרייה וריצוף. על ידי יישום גישות חלופיות אלה, חוקרים יכולים להשיג מערכי נתונים באיכות גבוהה, המאפשרים זיהוי של סוגי תאים עצביים ולא עצביים, פרופילי ביטוי גנים ומסלולי שושלת תאים. זה מאפשר חקירות מקיפות של תהליכים תאיים ומנגנונים מולקולריים המעצבים את התפתחות המוח.

Introduction

במהלך השנים האחרונות, טכנולוגיות אורגנואידים התגלו ככלי מבטיח לתרבית רקמות דמויות איברים ^1,2,3. במיוחד עבור איברים שלא ניתן לגשת אליהם בקלות, כגון המוח האנושי, אורגנואידים מציעים הזדמנות לקבל תובנות לגבי התפתחות וביטוי מחלות⁴. ככאלה, אורגנואידים במוח נמצאים בשימוש נרחב כמודל ניסיוני לחקר הפרעות מוח אנושיות שונות, כולל מחלות התפתחותיות, פסיכיאטריות או אפילו נוירודגנרטיביות ^4,5,6.

עם הופעתן של טכנולוגיות פרופיל שעתוק חד-תאי, רקמות אנו....

Protocol

הפרוטוקול המתואר מבוצע במעבדה ברמת בטיחות ביולוגית 1 של מרכז מקס דלבריק לרפואה מולקולרית (מספר אישור: 138/08), בהתאם לדרישות ובהתאם לכללי האתיקה של האיחוד האירופי והמדינה במחקר.

1. גזירה של אורגנואידים במוח הקדמי מתאי גזע פלוריפוטנטיים מושרים (iPSCs)

הערה: פ.......

Discussion

ניתוח שעתוק של תאים בודדים וגרעינים בודדים התגלה ככלי מרכזי להבנת מנגנוני בקרת גנים בתוך רקמות מורכבות. שתי השיטות מאפשרות מחקרי שעתוק של אורגנואידים במוח. כדי להבטיח ניסוי מוצלח כולל, איכות חומר המוצא היא בעלת רלוונטיות גבוהה. לכן, יש צורך לחתוך את האורגנואידים באופן קבוע כדי למנוע היווצ.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005