Generazione e analisi a valle di trascrittomi a singola cellula e a singolo nucleo in organoidi cerebrali

Summary

Qui, introduciamo un protocollo completo per la generazione e l'analisi a valle di organoidi cerebrali umani utilizzando il sequenziamento dell'RNA a singola cellula e a singolo nucleo.

Abstract

Nell'ultimo decennio, la trascrittomica a singola cellula si è evoluta in modo significativo ed è diventata un metodo di laboratorio standard per l'analisi simultanea dei profili di espressione genica delle singole cellule, consentendo la cattura della diversità cellulare. Al fine di superare i limiti posti dai tipi di cellule difficili da isolare, è possibile utilizzare un approccio alternativo che mira a recuperare singoli nuclei anziché cellule intatte, rendendo la profilazione del trascrittoma delle singole cellule universalmente applicabile. Queste tecniche sono diventate una pietra miliare nello studio degli organoidi cerebrali, affermandoli come modelli del cervello umano in via di sviluppo. Sfruttando il potenziale della trascrittomica a singola cellula e a singolo nucleo nella ricerca sugli organoidi cerebrali, questo protocollo presenta una guida passo-passo che comprende procedure chiave come la dissociazione degli organoidi, l'isolamento di singole cellule o nuclei, la preparazione e il sequenziamento delle librerie. Implementando questi approcci alternativi, i ricercatori possono ottenere set di dati di alta qualità, consentendo l'identificazione di tipi di cellule neuronali e non neuronali, profili di espressione genica e traiettorie di linea cellulare. Ciò facilita indagini complete sui processi cellulari e sui meccanismi molecolari che modellano lo sviluppo del cervello.

Introduction

Negli ultimi anni, le tecnologie degli organoidi sono emerse come uno strumento promettente per la coltura di tessuti simili a organi ^1,2,3. Soprattutto per gli organi che non sono facilmente accessibili, come il cervello umano, gli organoidi offrono l'opportunità di ottenere informazioni sullo sviluppo e sulla manifestazione della malattia⁴. In quanto tali, gli organoidi cerebrali sono stati ampiamente utilizzati come modello sperimentale per studiare vari disturbi del cervello umano, tra cui malattie dello sviluppo, psichiatriche o persino neurodegen....

Protocol

Il protocollo descritto viene eseguito in un laboratorio di biosicurezza di livello 1 del Max Delbrück Center for Molecular Medicine (numero di approvazione: 138/08), in conformità con i requisiti e in conformità con le norme dell'UE e nazionali sull'etica nella ricerca.

1. Derivazione di organoidi del prosencefalo da cellule staminali pluripotenti indotte (iPSCs)

NOTA: Questo protocollo è stato testato per diverse linee di iPSC coltivate in una v.......

Discussion

L'analisi trascrittomica di singole cellule e singoli nuclei è emersa come uno strumento fondamentale per comprendere i meccanismi di regolazione genica all'interno di tessuti complessi. Entrambi i metodi consentono studi sul trascrittoma di organoidi cerebrali. Per garantire un esperimento complessivamente riuscito, la qualità del materiale di partenza è di grande importanza. Pertanto, è necessario tagliare regolarmente gli organoidi per evitare la formazione di un nucleo necrotico²⁶. È anch.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005