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* These authors contributed equally
Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.
Na última década, a transcriptômica de célula única evoluiu significativamente e se tornou um método laboratorial padrão para análise simultânea de perfis de expressão gênica de células individuais, permitindo a captura da diversidade celular. A fim de superar as limitações impostas por tipos de células difíceis de isolar, uma abordagem alternativa com o objetivo de recuperar núcleos únicos em vez de células intactas pode ser utilizada para sequenciamento, tornando o perfil do transcriptoma de células individuais universalmente aplicável. Essas técnicas se tornaram uma pedra angular no estudo dos organoides cerebrais, estabelecendo-os como modelos do cérebro humano em desenvolvimento. Aproveitando o potencial da transcriptômica de célula única e núcleo único na pesquisa de organoides cerebrais, este protocolo apresenta um guia passo a passo que abrange procedimentos-chave, como dissociação de organoides, isolamento de célula única ou núcleo, preparação de biblioteca e sequenciamento. Ao implementar essas abordagens alternativas, os pesquisadores podem obter conjuntos de dados de alta qualidade, permitindo a identificação de tipos de células neuronais e não neuronais, perfis de expressão gênica e trajetórias de linhagem celular. Isso facilita investigações abrangentes sobre processos celulares e mecanismos moleculares que moldam o desenvolvimento do cérebro.
Nos últimos anos, as tecnologias organoides surgiram como uma ferramenta promissora para a cultura de tecidos semelhantes a órgãos 1,2,3. Especialmente para órgãos que não podem ser facilmente acessados, como o cérebro humano, os organoides oferecem a oportunidade de obter insights sobre o desenvolvimento e a manifestação da doença4. Como tal, os organoides cerebrais têm sido amplamente utilizados como modelo experimental para investigar vários distúrbios cerebrais humanos, incluindo doenças do desenvolvimento, psiquiátricas ou mesmo neurodegenerativas....
O protocolo descrito é realizado em um laboratório de nível de biossegurança 1 do Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (número de aprovação: 138/08), de acordo com os requisitos e em conformidade com as normas comunitárias e nacionais sobre ética em pesquisa.
1. Derivação de organoides do prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)
NOTA: Este protocolo foi testado para várias linhagens diferentes de iPSC.......
Para investigar a composição do tipo celular de organoides cerebrais usando scRNA-seq e snRNA-seq, os organoides cerebrais foram colhidos após 30 dias de cultivo, pois os organoides nesta fase já exibem alças neuroepiteliais consistindo de progenitores cercados por progenitores intermediários e neurônios em estágio inicial 4,18. Monitorar a qualidade dos organoides ao longo do crescimento e cultura é essencial para obter dados confiáveis de célula úni.......
A análise transcriptômica de células únicas e núcleos únicos emergiu como uma ferramenta fundamental para a compreensão dos mecanismos reguladores de genes em tecidos complexos. Ambos os métodos permitem estudos de transcriptoma de organoides cerebrais. Para garantir um experimento geral bem-sucedido, a qualidade do material de partida é de alta relevância. Portanto, é necessário cortar os organoides regularmente para evitar a formação de um núcleo necrótico26. Também é possível.......
Agradecemos a Valeria Fernandez-Vallone pelas instruções originais para o kit de dissociação neural Miltenyi. Também agradecemos à Plataforma de Tecnologia Genômica do Max Delbrueck Centrum por fornecer a receita para o tampão de lise NP40 e conselhos valiosos para configurar este protocolo. Também agradecemos a Margareta Herzog e Alexandra Tschernycheff pelo apoio organizacional do laboratório.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT) | Sigma | 43816-10ML | |
1.5 ml DNA low binding tubes | VWR | 525-0130 | microcentrifuge tube |
10x Cellranger pipeline | analysis pipline | ||
15 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
2-Mercaptoethanol (BME) | Life Technologies | 21985023 | |
50 ml Falcon | Falcon | Centrifuge tube | |
A83-01 | Bio Technologies | 379762 | |
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X) | Life Technologies | 15240062 | |
B-27 Plus Supplement | Life Technologies | 17504044 | |
B-27 Supplement without vitamin A | Life Technologies | 12587010 | |
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA) | Sigma Aldrich | A8806-5G | |
cAMP | Biogems | 6099240 | |
cAMP | Biogems | 6099240 | |
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED | VWR | DHC-N01 | |
Cell strainer 40 µm | Neolab | 352340 | |
Cell strainer 70 µm (white) Nylon | Sigma | CLS431751-50EA | |
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit | 10X Genomics | 1000204 | |
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns | 10X Genomics | 1000127 | |
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1 | 10X Genomics | 1000268 | |
Complete, EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill | Roche | 11873580001 | |
DAPI | MERCK Chemicals | 0000001722 | |
DMEM/F12 | Life Technologies | 11320074 | |
Dounce tissue grinder set 2 mL complete | Sigma Aldrich | 10536355 | |
Essential E8 Flex Medium | Life Technologies | A2858501 | |
EVE Cell Counting Slides | VWR | EVS-050 ( 734-2676) | |
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS) | PAN Biotech | P30-3602 | |
Geltrex LDEV-Free (coating) | Life Technologies | A1413302 | |
gentleMACS | Miltenyi Biotec | dissociation maschine | |
GlutaMAX supplements | Life Technologies | 35050038 | |
Heparin sodium cell culture tested | Sigma | H3149-10KU | |
human recombinant BDNF | StemCell Technologies | 78005.3 | |
human recombinant GDNF | StemCell Technologies | 78058.3 | |
Insulin Solution Human | Sigma Aldrich | I2643-25MG | |
Knockout serum replacement | Life Technologies | 10828028 | |
LDN193189 Hydrochloride 98% | Sigma Aldrich | 130-106-540 | |
MEM non-essential amino acid (100x) | Sigma Aldrich | M7145-100ml | |
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free | Thermo Scientific | AM9530G | |
mTeSR Plus | StemCell Technologies | 100-0276 | stem cell medium |
mTeSR1 | StemCell Technologies | 85850 | stem cell medium |
N2 Supplement | StemCell Technologies | 17502048 | |
Neural Tissue Dissociation Kit | Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG | 130-092-628 | |
Neurobasal Plus | Life Technologies | A3582901 | |
NextSeq500 system | Illumina | Sequencer | |
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution | Life Technologies | 28324 | |
PBS Dulbecco’s | Invitrogen | 14190169 | |
PenStrep (Penicillin - Streptomycin) | Life Technologies | 15140122 | |
Percoll | Th. Geyer | 10668276 | |
Pluronic (R) F-127 | Sigma Aldrich | P2443-1KG | |
RiboLock RNase Inhibitor | Life Technologies | EO0382 | |
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB | Biomol | Cay10005583-10 | |
SB 431542 | Biogems | 3014193 | |
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL | Invitrogen | AM9760G | |
StemFlex Medium | Thermo Scientific | A3349401 | stem cell medium |
StemMACS iPS-Brew XF | Miltenyi Biotec | 130-104-368 | stem cell medium |
TC-Platte 96 Well, round bottom | Sarstedt | 83.3925.500 | |
TISSUi006-A | TissUse GmbH | https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A | |
Trypan Blue | T8154-20ml | Sigma | |
TrypLE Express Enzyme, no phenol red | Life Technologies | 12604013 | Trypsin-based reagent |
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5 | Life Technologies | 15567027 | |
XAV939 | Enzo Life sciences | BML-WN100-0005 |
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