Geração e análise a jusante de transcriptomas de célula única e núcleo único em organoides cerebrais

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.

Abstract

Na última década, a transcriptômica de célula única evoluiu significativamente e se tornou um método laboratorial padrão para análise simultânea de perfis de expressão gênica de células individuais, permitindo a captura da diversidade celular. A fim de superar as limitações impostas por tipos de células difíceis de isolar, uma abordagem alternativa com o objetivo de recuperar núcleos únicos em vez de células intactas pode ser utilizada para sequenciamento, tornando o perfil do transcriptoma de células individuais universalmente aplicável. Essas técnicas se tornaram uma pedra angular no estudo dos organoides cerebrais, estabelecendo-os como modelos do cérebro humano em desenvolvimento. Aproveitando o potencial da transcriptômica de célula única e núcleo único na pesquisa de organoides cerebrais, este protocolo apresenta um guia passo a passo que abrange procedimentos-chave, como dissociação de organoides, isolamento de célula única ou núcleo, preparação de biblioteca e sequenciamento. Ao implementar essas abordagens alternativas, os pesquisadores podem obter conjuntos de dados de alta qualidade, permitindo a identificação de tipos de células neuronais e não neuronais, perfis de expressão gênica e trajetórias de linhagem celular. Isso facilita investigações abrangentes sobre processos celulares e mecanismos moleculares que moldam o desenvolvimento do cérebro.

Introduction

Nos últimos anos, as tecnologias organoides surgiram como uma ferramenta promissora para a cultura de tecidos semelhantes a órgãos ^1,2,3. Especialmente para órgãos que não podem ser facilmente acessados, como o cérebro humano, os organoides oferecem a oportunidade de obter insights sobre o desenvolvimento e a manifestação da doença⁴. Como tal, os organoides cerebrais têm sido amplamente utilizados como modelo experimental para investigar vários distúrbios cerebrais humanos, incluindo doenças do desenvolvimento, psiquiátricas ou mesmo neurodegenerativas....

Protocol

O protocolo descrito é realizado em um laboratório de nível de biossegurança 1 do Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (número de aprovação: 138/08), de acordo com os requisitos e em conformidade com as normas comunitárias e nacionais sobre ética em pesquisa.

1. Derivação de organoides do prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)

NOTA: Este protocolo foi testado para várias linhagens diferentes de iPSC.......

Discussion

A análise transcriptômica de células únicas e núcleos únicos emergiu como uma ferramenta fundamental para a compreensão dos mecanismos reguladores de genes em tecidos complexos. Ambos os métodos permitem estudos de transcriptoma de organoides cerebrais. Para garantir um experimento geral bem-sucedido, a qualidade do material de partida é de alta relevância. Portanto, é necessário cortar os organoides regularmente para evitar a formação de um núcleo necrótico²⁶. Também é possível.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005