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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Aqui, apresentamos um protocolo abrangente para a geração e análise a jusante de organoides cerebrais humanos usando sequenciamento de RNA de célula única e núcleo único.

Abstract

Na última década, a transcriptômica de célula única evoluiu significativamente e se tornou um método laboratorial padrão para análise simultânea de perfis de expressão gênica de células individuais, permitindo a captura da diversidade celular. A fim de superar as limitações impostas por tipos de células difíceis de isolar, uma abordagem alternativa com o objetivo de recuperar núcleos únicos em vez de células intactas pode ser utilizada para sequenciamento, tornando o perfil do transcriptoma de células individuais universalmente aplicável. Essas técnicas se tornaram uma pedra angular no estudo dos organoides cerebrais, estabelecendo-os como modelos do cérebro humano em desenvolvimento. Aproveitando o potencial da transcriptômica de célula única e núcleo único na pesquisa de organoides cerebrais, este protocolo apresenta um guia passo a passo que abrange procedimentos-chave, como dissociação de organoides, isolamento de célula única ou núcleo, preparação de biblioteca e sequenciamento. Ao implementar essas abordagens alternativas, os pesquisadores podem obter conjuntos de dados de alta qualidade, permitindo a identificação de tipos de células neuronais e não neuronais, perfis de expressão gênica e trajetórias de linhagem celular. Isso facilita investigações abrangentes sobre processos celulares e mecanismos moleculares que moldam o desenvolvimento do cérebro.

Introduction

Nos últimos anos, as tecnologias organoides surgiram como uma ferramenta promissora para a cultura de tecidos semelhantes a órgãos 1,2,3. Especialmente para órgãos que não podem ser facilmente acessados, como o cérebro humano, os organoides oferecem a oportunidade de obter insights sobre o desenvolvimento e a manifestação da doença4. Como tal, os organoides cerebrais têm sido amplamente utilizados como modelo experimental para investigar vários distúrbios cerebrais humanos, incluindo doenças do desenvolvimento, psiquiátricas ou mesmo neurodegenerativas....

Protocol

O protocolo descrito é realizado em um laboratório de nível de biossegurança 1 do Centro Max Delbrück de Medicina Molecular (número de aprovação: 138/08), de acordo com os requisitos e em conformidade com as normas comunitárias e nacionais sobre ética em pesquisa.

1. Derivação de organoides do prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs)

NOTA: Este protocolo foi testado para várias linhagens diferentes de iPSC.......

Representative Results

Para investigar a composição do tipo celular de organoides cerebrais usando scRNA-seq e snRNA-seq, os organoides cerebrais foram colhidos após 30 dias de cultivo, pois os organoides nesta fase já exibem alças neuroepiteliais consistindo de progenitores cercados por progenitores intermediários e neurônios em estágio inicial 4,18. Monitorar a qualidade dos organoides ao longo do crescimento e cultura é essencial para obter dados confiáveis de célula úni.......

Discussion

A análise transcriptômica de células únicas e núcleos únicos emergiu como uma ferramenta fundamental para a compreensão dos mecanismos reguladores de genes em tecidos complexos. Ambos os métodos permitem estudos de transcriptoma de organoides cerebrais. Para garantir um experimento geral bem-sucedido, a qualidade do material de partida é de alta relevância. Portanto, é necessário cortar os organoides regularmente para evitar a formação de um núcleo necrótico26. Também é possível.......

Disclosures

Os autores declaram não haver interesses financeiros concorrentes.

Acknowledgements

Agradecemos a Valeria Fernandez-Vallone pelas instruções originais para o kit de dissociação neural Miltenyi. Também agradecemos à Plataforma de Tecnologia Genômica do Max Delbrueck Centrum por fornecer a receita para o tampão de lise NP40 e conselhos valiosos para configurar este protocolo. Também agradecemos a Margareta Herzog e Alexandra Tschernycheff pelo apoio organizacional do laboratório.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)Sigma 43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes VWR525-0130microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline analysis pipline
15 ml FalconFalconCentrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)Life Technologies21985023
50 ml FalconFalconCentrifuge tube
A83-01Bio Technologies379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)Life Technologies15240062
B-27 Plus SupplementLife Technologies17504044
B-27 Supplement without vitamin ALife Technologies12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)Sigma AldrichA8806-5G 
cAMPBiogems6099240
cAMPBiogems6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVEDVWRDHC-N01
Cell strainer 40 µmNeolab352340
Cell strainer 70 µm (white) NylonSigmaCLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit10X Genomics1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns10X Genomics1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.110X Genomics1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor CocktaillRoche11873580001
DAPIMERCK Chemicals0000001722
DMEM/F12Life Technologies11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL completeSigma Aldrich10536355
Essential E8 Flex MediumLife TechnologiesA2858501
EVE Cell Counting SlidesVWREVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)PAN BiotechP30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)Life TechnologiesA1413302 
gentleMACSMiltenyi Biotecdissociation maschine
GlutaMAX supplementsLife Technologies35050038
Heparin sodium cell culture testedSigmaH3149-10KU
human recombinant BDNFStemCell Technologies78005.3
human recombinant GDNFStemCell Technologies78058.3
Insulin Solution HumanSigma AldrichI2643-25MG
Knockout serum replacementLife Technologies10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%Sigma Aldrich130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)Sigma AldrichM7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse freeThermo ScientificAM9530G
mTeSR PlusStemCell Technologies100-0276stem cell medium
mTeSR1StemCell Technologies85850stem cell medium
N2 Supplement StemCell Technologies17502048
Neural Tissue Dissociation KitMiltenyi Biotec B.V. & Co. KG130-092-628
Neurobasal PlusLife TechnologiesA3582901
NextSeq500 systemIlluminaSequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent SolutionLife Technologies28324
PBS Dulbecco’sInvitrogen14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)Life Technologies15140122
PercollTh. Geyer10668276
Pluronic (R) F-127Sigma AldrichP2443-1KG
RiboLock RNase InhibitorLife Technologies EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SBBiomolCay10005583-10
SB 431542 Biogems3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mLInvitrogenAM9760G
StemFlex MediumThermo ScientificA3349401stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XFMiltenyi Biotec130-104-368stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottomSarstedt83.3925.500
TISSUi006-ATissUse GmbHhttps://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan BlueT8154-20mlSigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol redLife Technologies12604013Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5Life Technologies15567027
XAV939Enzo Life sciencesBML-WN100-0005

References

  1. Finkbeiner, S. R., et al. Stem cell-derived human intestinal organoids as an infection model for Rotaviruses. mBio. 3 (4), e00159-e00212 (2012).
  2. Freedman, B. S., et al.

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