Генерация и последующий анализ одноклеточных и одноядерных транскриптомов в органоидах мозга

Summary

В этой статье мы представляем комплексный протокол для генерации и последующего анализа органоидов человеческого мозга с использованием секвенирования одиночных клеток и одноядерных РНК.

Abstract

За последнее десятилетие транскриптомика одиночных клеток значительно эволюционировала и стала стандартным лабораторным методом для одновременного анализа профилей экспрессии генов отдельных клеток, позволяющим улавливать клеточное разнообразие. Для преодоления ограничений, связанных с трудно изолируемыми типами клеток, для секвенирования может быть использован альтернативный подход, направленный на восстановление отдельных ядер вместо интактных клеток, что делает транскриптомное профилирование отдельных клеток универсально применимым. Эти методы стали краеугольным камнем в изучении органоидов мозга, установив их в качестве моделей развивающегося человеческого мозга. Используя потенциал одноклеточной и одноядерной транскриптомики в исследованиях органоидов мозга, этот протокол представляет собой пошаговое руководство, охватывающее ключевые процедуры, такие как диссоциация органоидов, выделение одиночных клеток или ядер, подготовка библиотеки и секвенирование. Реализуя эти альтернативные подходы, исследователи могут получить высококачественные наборы данных, позволяющие идентифицировать типы нейронных и ненейрональных клеток, профили экспрессии генов и траектории клеточной линии. Это способствует всестороннему исследованию клеточных процессов и молекулярных механизмов, формирующих развитие мозга.

Introduction

В последние годы органоидные технологии стали перспективным инструментом для культивирования органоподобных тканей ^1,2,3. Особенно для органов, которые не могут быть легко доступны, таких как человеческий мозг, органоиды дают возможность получить представление о развитии^{и проявлении} болезней. Таким образом, органоиды мозга широко используются в качестве экспериментальной модели для исследования различных расстройств мозга человека, включая заболевания развития, психиатрические или даже

Protocol

Описанный протокол выполнен в лаборатории уровня биобезопасности 1 Центра молекулярной медицины им. Макса Дельбрюка (номер одобрения: 138/08), в соответствии с требованиями и в соответствии с правилами ЕС и национальными правилами этики в исследованиях.

1. Получение орга.......

Discussion

Транскриптомный анализ отдельных клеток и отдельных ядер стал ключевым инструментом для понимания механизмов регуляции генов в сложных тканях. Оба метода позволяют проводить транскриптомные исследования органоидов мозга. Для обеспечения общего успеха эксперимента большое значение.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1,4-DITHIO-DL-THREIT-LSG., F. D. MOL.-BIOL., ~1 M IN H2O (DTT)	Sigma	43816-10ML
1.5 ml DNA low binding tubes	VWR	525-0130	microcentrifuge tube
10x Cellranger pipeline			analysis pipline
15 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
2-Mercaptoethanol (BME)	Life Technologies	21985023
50 ml Falcon	Falcon		Centrifuge tube
A83-01	Bio Technologies	379762
Antibiotic/Antimycotic Solution (100X)	Life Technologies	15240062
B-27 Plus Supplement	Life Technologies	17504044
B-27 Supplement without vitamin A	Life Technologies	12587010
Bovine serum albumin, fatty acid free (BSA)	Sigma Aldrich	A8806-5G
cAMP	Biogems	6099240
cAMP	Biogems	6099240
C-CHIP NEUBAUER IMPROVED	VWR	DHC-N01
Cell strainer 40 µm	Neolab	352340
Cell strainer 70 µm (white) Nylon	Sigma	CLS431751-50EA
Chromium Controller & Next GEM Accessory Kit	10X Genomics	1000204
Chromium Next GEM Chip G Single Cell Kit, 16 rxns	10X Genomics	1000127
Chromium Next GEM Single Cell 3' Kit v3.1	10X Genomics	1000268
Complete,  EDTA-free Protease Inhibitor Cocktaill	Roche	11873580001
DAPI	MERCK Chemicals	0000001722
DMEM/F12	Life Technologies	11320074
Dounce tissue grinder set 2 mL complete	Sigma Aldrich	10536355
Essential E8 Flex Medium	Life Technologies	A2858501
EVE Cell Counting Slides	VWR	EVS-050 ( 734-2676)
Foetal bovine serum tetracycline free (FBS)	PAN Biotech	P30-3602
Geltrex LDEV-Free (coating)	Life Technologies	A1413302
gentleMACS	Miltenyi Biotec		dissociation maschine
GlutaMAX supplements	Life Technologies	35050038
Heparin sodium cell culture tested	Sigma	H3149-10KU
human recombinant BDNF	StemCell Technologies	78005.3
human recombinant GDNF	StemCell Technologies	78058.3
Insulin Solution Human	Sigma Aldrich	I2643-25MG
Knockout serum replacement	Life Technologies	10828028
LDN193189 Hydrochloride 98%	Sigma Aldrich	130-106-540
MEM non-essential amino acid (100x)	Sigma Aldrich	M7145-100ml
MgCl2 Magnesium Chloride (1M) RNAse free	Thermo Scientific	AM9530G
mTeSR Plus	StemCell Technologies	100-0276	stem cell medium
mTeSR1	StemCell Technologies	85850	stem cell medium
N2 Supplement	StemCell Technologies	17502048
Neural Tissue Dissociation Kit	Miltenyi Biotec B.V. & Co. KG	130-092-628
Neurobasal Plus	Life Technologies	A3582901
NextSeq500 system	Illumina		Sequencer
NP-40 Surfact-Amps Detergent Solution	Life Technologies	28324
PBS Dulbecco’s	Invitrogen	14190169
PenStrep (Penicillin - Streptomycin)	Life Technologies	15140122
Percoll	Th. Geyer	10668276
Pluronic (R) F-127	Sigma Aldrich	P2443-1KG
RiboLock RNase Inhibitor	Life Technologies	EO0382
Rock Inhibitor (Y-27632 dihydrochloride) SB	Biomol	Cay10005583-10
SB 431542	Biogems	3014193
Sodium chloride NaCl (5M), RNase-free-100 mL	Invitrogen	AM9760G
StemFlex Medium	Thermo Scientific	A3349401	stem cell medium
StemMACS iPS-Brew XF	Miltenyi Biotec	130-104-368	stem cell medium
TC-Platte 96 Well, round bottom	Sarstedt	83.3925.500
TISSUi006-A	TissUse GmbH	https://hpscreg.eu/cell-line/TISSUi006-A
Trypan Blue	T8154-20ml	Sigma
TrypLE Express Enzyme, no phenol red	Life Technologies	12604013	Trypsin-based reagent
UltraPure 1M Tris-HCl Buffer, pH 7.5	Life Technologies	15567027
XAV939	Enzo Life sciences	BML-WN100-0005