Un insieme di mezzi di comunicazione simulati informati in situ per la coltura di microrganismi anaerobici acquisiti nell'ambiente

Summary

L'obiettivo di questo documento è quello di descrivere in dettaglio le migliori pratiche per la produzione di terreni per microrganismi anaerobici fastidiosi acquisiti da un ambiente. Questi metodi aiutano a gestire le colture anaerobiche e possono essere applicati per supportare la crescita di microrganismi non coltivati elusivi, la "materia oscura microbica".

Abstract

La ricerca sui microrganismi anaerobi dipendente dalla coltura si basa sulla competenza metodologica. Questi metodi devono creare e mantenere condizioni di crescita adeguate (ad esempio, pH e fonti di carbonio) per i microrganismi anaerobici, consentendo al contempo l'estrazione di campioni senza compromettere l'ambiente artificiale. A tal fine, i metodi che si basano e simulano un ambiente in situ possono essere di grande aiuto nella coltura di microrganismi provenienti da quell'ambiente. Qui, descriviamo un metodo anaerobico in situ informato e simulato per la coltura di microrganismi terrestri superficiali e sotterranei, enfatizzando la raccolta di campioni anaerobici con perturbazioni minime. Questo protocollo descrive in dettaglio la produzione di un mezzo liquido anaerobico personalizzabile e l'acquisizione ambientale e la crescita in vitro di microrganismi anaerobici. Il protocollo copre anche i componenti critici di un bioreattore anaerobico utilizzato per simulazioni ambientali di sedimenti e mezzi liquidi anaerobici per colture acquisite in ambiente. Abbiamo incluso i dati preliminari di sequenziamento di nuova generazione da un microbioma mantenuto per tutta la durata di vita di un bioreattore in cui la coltura attiva si è regolata dinamicamente in risposta a una fonte sperimentale di carbonio.

Introduction

La maggior parte dei microrganismi rimane non coltivata; Ciò è supportato dalla grande disparità tra le cellule osservata attraverso la microscopia, contrastata dai pochi microrganismi coltivati con successo utilizzando piastre di agar. Staley e Konopka chiamarono questa disparità "Anomalia del Conteggio delle Grandi Placche"¹. La diversità stimata non contabilizzata è supportata da dati metagenomici e metatrascrittomici che mostrano molti nuovi generi distribuiti in curve di abbondanza di rango provenienti da diversi ambienti². I microrganismi che sono stati osservati (generalmente mediante sequenz....

Protocol

1. Produzione di mezzo liquido anaerobico personalizzabile

1. Terreno per flaconi di coltura (produzione di 500 ml)
   1. Misurare e aggiungere composti in un flacone da 1 L e regolare il pH utilizzando la colonna nella Tabella 1 corrispondente alla cultura di interesse del lettore (le quantità nella Tabella 1 sono registrate per una produzione di 1.000 mL, regolare di conseguenza). Mescolare i composti fino a ottenere omogeneità facendo roteare la bottiglia.

Discussion

La sezione di produzione media di questo protocollo (sezione 1) deve la sua struttura alla tecnica Hungate modificata di Miller e Wolin¹⁷, che è stata ampiamente utilizzata sin dalla sua pubblicazione. La praticità di questo protocollo ampliato deriva dalla sua natura descrittiva e dall'abbinamento con l'acquisizione in situ di microrganismi. I flaconi di coltura contenenti terreni informati e simulati dal punto di vista ambientale sono stati utilizzati per coltivare con successo i segu.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
General Materials
1 L borosillicate bottle	Fisher Scientific
1 mL syringe with slip tip	Fisher Scientific
10 mL glass pipette	Fisher Scientific
100 mL culture bottle	Fisher Scientifc
20 mm hand crimper	Fisher Scientifc
23 G needle	Fisher Scientifc
500 mL borosilicate bottle	Fisher Scientific
Aluminum seal	Fisher Scientifc
Cannula, 31.5 cm length	Fisher Scientific
Cannula, 6 cm length	Fisher Scientifc
Corer	Giddings Machine Company		Assembled from company parts
Gas manifold	Swagelok		Assembled from many different parts
Lighter	Lowe's
N2 gas	Airgas
Nitrile gloves	Fisher Scientific
Rubber stopper (for GL45 bottles)	Glasgeratebau OCHS
Rubber stopper (for culture bottles)	Ace Glass
Stirring hot plate	Corning
Trace minerals	ATCC
Vitamins	ATCC
Bioreactor-specific Materials
#10 rubber stopper	Ace Glass
#7 rubber stopper	Fisher Scientifc
1 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
1/4" hose barb ball valve	Amazon
10 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
3.5 L borosilicate bottle	Fisher Scientific
5/16" - 1/4" hose barb adapter fitting	Amazon
60 mL syringe with luer lock tip	Fisher Scientifc
8 L borosillicate carboy	Allen Glass
Angled hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-20
Balloon	Party City
Borosillicate bioreactor	Allen Scientific Glass		Custom made upon request
Drill	Lowe's
Female luer lock adapter coupler	Amazon
GL14 open top cap	Ace Glass	7621-04
GL18 open top cap	Ace Glass	7621-08
GL45 open top cap	Ace Glass
PTFE faced silicone septum for GL14 open top cap	Ace Glass	7625-06
PTFE faced silicone septum for GL18 open top cap	Ace Glass	7625-07
Ring stand	Fisher Scientific
Ring stand chain clamp	Amazon
Ring stand clamp	Fisher Scientific
Silicone tubing; 1/4" id, 1/2" od	Grainger	55YG13
Silicone tubing; 3/16" id, 3/8" od	Grainger
Straight hose connector for GL14 open top cap	Ace Glass	7623-22
Three-way stopcock	Amazon
Two-way stopcock	Amazon
Ultra low flow variable flow mini-pump	VWR
Water bath	Fisher Scientifc
White rubber septum for 13-18 mm od tubes	Ace Glass	9096-49
Wire	Lowe's
Zip tie	Lowe's