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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Il protocollo delinea un metodo fattibile, affidabile e riproducibile di clampaggio ilare polmonare sinistro che può essere utilizzato per studiare il danno da ischemia-riperfusione polmonare in modelli murini.

Abstract

Il danno da ischemia e riperfusione (IRI) durante il trapianto di polmone è un importante fattore di rischio per le complicanze post-trapianto, tra cui la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto acuto e cronico e la mortalità. Gli sforzi per studiare le basi dell'IRI hanno portato allo sviluppo di un modello murino affidabile e riproducibile di clamping ilare del polmone sinistro. Questo modello prevede una procedura chirurgica eseguita in un topo anestetizzato e intubato. Viene eseguita una toracotomia sinistra, seguita da un'attenta mobilizzazione polmonare e dalla dissezione dell'ilo polmonare sinistro. Il morsetto ilare comporta la legatura reversibile della sutura dell'ilo polmonare con un nodo scorsoio, che interrompe l'afflusso arterioso, il deflusso venoso e il flusso d'aria attraverso il bronco principale sinistro. La riperfusione viene avviata con un'attenta rimozione della sutura. Il nostro laboratorio utilizza 30 minuti di ischemia e 1 ora di riperfusione per il modello sperimentale nelle attuali indagini. Tuttavia, questi periodi di tempo possono essere modificati a seconda della specifica domanda sperimentale. Immediatamente prima del sacrificio, l'emogasanalisi arteriosa può essere prelevata dal ventricolo sinistro dopo un periodo di 4 minuti di clampaggio ilare destro per garantire che i valori di PaO2 ottenuti siano attribuiti al solo polmone sinistro danneggiato. Descriviamo anche un metodo per misurare lo stravaso cellulare con la citometria a flusso, che prevede l'iniezione endovenosa di un anticorpo marcato con fluorocromo specifico per le cellule da studiare prima del sacrificio. Il polmone sinistro può quindi essere prelevato per la citometria a flusso, congelato o fissato, l'immunoistochimica inclusa in paraffina e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Questa tecnica di clamp ilare consente uno studio dettagliato dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dell'IRI. I risultati rappresentativi rivelano una diminuzione dell'ossigenazione del polmone sinistro e l'evidenza istologica di danno polmonare a seguito di clamping ilare. Questa tecnica può essere facilmente appresa e riprodotta da personale con e senza esperienza microchirurgica, portando a risultati affidabili e coerenti e fungendo da modello ampiamente adottabile per lo studio dell'IRI polmonare.

Introduction

L'IRI durante il trapianto d'organo è un importante fattore di rischio per la disfunzione primaria del trapianto e per i successivi episodi di rigetto del trapianto 1,2. Durante il trapianto, il tempo di ischemia calda è definito come il periodo di tempo che intercorre tra il cross-clamp dell'aorta del donatore e l'inizio della perfusione fredda e tra la rimozione dell'organo dal ghiaccio all'impianto dell'organo. Il tempo di conservazione a freddo è definito come il periodo di tempo che intercorre tra l'inizio della perfusione fredda e la rimozione dell'organo dal ghiaccio3. L'ischemia....

Protocol

Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Washington University School of Medicine. Gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8aedizione 21 preparata dalla National Academy of Sciences e pubblicata dal National Institutes of Health, e i Principi di cura degli animali da laboratorio formulati dalla National Society for Medical Research.

Representative Results

Dopo il clamping ilare sinistro, la pressione parziale di ossigenazione nel sangue arterioso (PaO2) attribuita al polmone sinistro è di ~100 mmHg, significativamente più bassa rispetto ai ~500 mmHg dopo la toracotomia fittizia (Figura 7A, n=6-7). Da notare che sono state eseguite toracotomie fittizie in topi B6 con misurazione ABG presa dopo 4 minuti di clamping ilare destro, che rappresentano valori attribuiti al solo polmone sinistro. La colorazione H&E del polmone sinistro co.......

Discussion

Descriviamo una tecnica di clamp ilare che prevede l'applicazione di un nodo scorsoio sull'ilo sinistro che occlude l'arteria polmonare e le vene e i bronchi per indurre l'ischemia calda seguita da riperfusione. Dopo il clampaggio ilare, il polmone sinistro può essere prelevato per una varietà di tecniche sperimentali come l'istologia, la citometria a flusso, il sequenziamento di massa o di singole cellule e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Inoltre, il sangue e la milza possono essere utilizzati per .......

Disclosures

Gli autori non riportano alcuna divulgazione rilevante.

Acknowledgements

Questo lavoro non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifica da alcuna agenzia di finanziamento nei settori pubblico, commerciale o senza scopo di lucro.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Medications
10% povidone-iodine solutionAplicareNDC 52380-0126-2For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mLFidelis Animal HealthNDC 86084-100-30For pain control
CarprofenCronus PharmaNDC 69043-027-18For pain control
Heparin 1000 units/mLSagentNDC 25021-404-01For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%Sigma Aldrich26675-46-7For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mLVedcoNDC 50989-996-06For anesthesia
Puralube Vet eye ointmentMedi-Vet.com11897To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mLAkornNDC 59399-110-20For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery PenMcKesson231To coagulate blood vessels
Curved mosquito clampFine Science Tools13009-12For surgical procedure
Fine curved forcepsFine Science Tools11274-20For surgical procedure
Fine scissorsFine Science Tools15040-11For surgical procedure
Intubation clamp set-upFine Science Tools18374-44, 18144-30For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A. 
Magnetic rib retractorsFine Science Tools18200-01, 18200-10For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μmEdmund Optics02-532To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipperOster078400-020-001To clip hair
ScissorsFine Science Tools14370-22For surgical procedure
Small animal heating padK&H Pet ProductsThermo-Peep Heated PadTo maintain normothermia
Small animal ventilatorHarvard Apparatus55-0000For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)Amazon.comhttps://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas AnalyzerNova Biomedicalhttps://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx
ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33
2aM8WGPiUVhicPQZ
Wj2AaAqhDEALw_wcB  
For retraction of thoracotomy
Straight clampFine Science Tools13008-12For surgical procedure
Straight forcepsFine Science Tools91113-10For surgical procedure
Surgical microscopeWild Heerbruggno longer producedFor intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needleMcKesson942665For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringeMcKesson16-SNT1C2705For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheterTerumoSROX2025CAFor endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tapeDurapore3M ID 7100057168To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needleMcKesson102-SN310C31516PFor antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needleMcKessonS697GXFor closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tieSurgical Specialties LookSP102To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicatorsSolon56225To manipulate lung and for blunt dissection

References

  1. Bharat, A., et al. Immunological link between primary graft dysfunction and chronic lung allograft rejection. Ann Thorac Surg. 86 (1), 189-195 (2008).
  2. Daud, S. A. Impact o....

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Parole chiave MurinoMorsetto ilare polmonare sinistroLesione da riperfusione per ischemia polmonareIRITrapianto di polmoneModello murinoProcedura chirurgicaIlo polmonareMorsetto ilareIschemiaRiperfusioneEmogasanalisi arteriosaStravaso cellulareCitometria a flussoImmunoistochimicaPCR quantitativa

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