Modello murino di morsetto ilare polmonare sinistro di lesione da riperfusione da ischemia polmonare

Summary

Il protocollo delinea un metodo fattibile, affidabile e riproducibile di clampaggio ilare polmonare sinistro che può essere utilizzato per studiare il danno da ischemia-riperfusione polmonare in modelli murini.

Abstract

Il danno da ischemia e riperfusione (IRI) durante il trapianto di polmone è un importante fattore di rischio per le complicanze post-trapianto, tra cui la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto acuto e cronico e la mortalità. Gli sforzi per studiare le basi dell'IRI hanno portato allo sviluppo di un modello murino affidabile e riproducibile di clamping ilare del polmone sinistro. Questo modello prevede una procedura chirurgica eseguita in un topo anestetizzato e intubato. Viene eseguita una toracotomia sinistra, seguita da un'attenta mobilizzazione polmonare e dalla dissezione dell'ilo polmonare sinistro. Il morsetto ilare comporta la legatura reversibile della sutura dell'ilo polmonare con un nodo scorsoio, che interrompe l'afflusso arterioso, il deflusso venoso e il flusso d'aria attraverso il bronco principale sinistro. La riperfusione viene avviata con un'attenta rimozione della sutura. Il nostro laboratorio utilizza 30 minuti di ischemia e 1 ora di riperfusione per il modello sperimentale nelle attuali indagini. Tuttavia, questi periodi di tempo possono essere modificati a seconda della specifica domanda sperimentale. Immediatamente prima del sacrificio, l'emogasanalisi arteriosa può essere prelevata dal ventricolo sinistro dopo un periodo di 4 minuti di clampaggio ilare destro per garantire che i valori di PaO₂ ottenuti siano attribuiti al solo polmone sinistro danneggiato. Descriviamo anche un metodo per misurare lo stravaso cellulare con la citometria a flusso, che prevede l'iniezione endovenosa di un anticorpo marcato con fluorocromo specifico per le cellule da studiare prima del sacrificio. Il polmone sinistro può quindi essere prelevato per la citometria a flusso, congelato o fissato, l'immunoistochimica inclusa in paraffina e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Questa tecnica di clamp ilare consente uno studio dettagliato dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dell'IRI. I risultati rappresentativi rivelano una diminuzione dell'ossigenazione del polmone sinistro e l'evidenza istologica di danno polmonare a seguito di clamping ilare. Questa tecnica può essere facilmente appresa e riprodotta da personale con e senza esperienza microchirurgica, portando a risultati affidabili e coerenti e fungendo da modello ampiamente adottabile per lo studio dell'IRI polmonare.

Introduction

L'IRI durante il trapianto d'organo è un importante fattore di rischio per la disfunzione primaria del trapianto e per i successivi episodi di rigetto del trapianto ^1,2. Durante il trapianto, il tempo di ischemia calda è definito come il periodo di tempo che intercorre tra il cross-clamp dell'aorta del donatore e l'inizio della perfusione fredda e tra la rimozione dell'organo dal ghiaccio all'impianto dell'organo. Il tempo di conservazione a freddo è definito come il periodo di tempo che intercorre tra l'inizio della perfusione fredda e la rimozione dell'organo dal ghiaccio³. L'ischemia....

Protocol

Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Washington University School of Medicine. Gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8a^{edizione 21} preparata dalla National Academy of Sciences e pubblicata dal National Institutes of Health, e i Principi di cura degli animali da laboratorio formulati dalla National Society for Medical Research.

Discussion

Descriviamo una tecnica di clamp ilare che prevede l'applicazione di un nodo scorsoio sull'ilo sinistro che occlude l'arteria polmonare e le vene e i bronchi per indurre l'ischemia calda seguita da riperfusione. Dopo il clampaggio ilare, il polmone sinistro può essere prelevato per una varietà di tecniche sperimentali come l'istologia, la citometria a flusso, il sequenziamento di massa o di singole cellule e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Inoltre, il sangue e la milza possono essere utilizzati per .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection