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Il protocollo delinea un metodo fattibile, affidabile e riproducibile di clampaggio ilare polmonare sinistro che può essere utilizzato per studiare il danno da ischemia-riperfusione polmonare in modelli murini.
Il danno da ischemia e riperfusione (IRI) durante il trapianto di polmone è un importante fattore di rischio per le complicanze post-trapianto, tra cui la disfunzione primaria del trapianto, il rigetto acuto e cronico e la mortalità. Gli sforzi per studiare le basi dell'IRI hanno portato allo sviluppo di un modello murino affidabile e riproducibile di clamping ilare del polmone sinistro. Questo modello prevede una procedura chirurgica eseguita in un topo anestetizzato e intubato. Viene eseguita una toracotomia sinistra, seguita da un'attenta mobilizzazione polmonare e dalla dissezione dell'ilo polmonare sinistro. Il morsetto ilare comporta la legatura reversibile della sutura dell'ilo polmonare con un nodo scorsoio, che interrompe l'afflusso arterioso, il deflusso venoso e il flusso d'aria attraverso il bronco principale sinistro. La riperfusione viene avviata con un'attenta rimozione della sutura. Il nostro laboratorio utilizza 30 minuti di ischemia e 1 ora di riperfusione per il modello sperimentale nelle attuali indagini. Tuttavia, questi periodi di tempo possono essere modificati a seconda della specifica domanda sperimentale. Immediatamente prima del sacrificio, l'emogasanalisi arteriosa può essere prelevata dal ventricolo sinistro dopo un periodo di 4 minuti di clampaggio ilare destro per garantire che i valori di PaO2 ottenuti siano attribuiti al solo polmone sinistro danneggiato. Descriviamo anche un metodo per misurare lo stravaso cellulare con la citometria a flusso, che prevede l'iniezione endovenosa di un anticorpo marcato con fluorocromo specifico per le cellule da studiare prima del sacrificio. Il polmone sinistro può quindi essere prelevato per la citometria a flusso, congelato o fissato, l'immunoistochimica inclusa in paraffina e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Questa tecnica di clamp ilare consente uno studio dettagliato dei meccanismi cellulari e molecolari alla base dell'IRI. I risultati rappresentativi rivelano una diminuzione dell'ossigenazione del polmone sinistro e l'evidenza istologica di danno polmonare a seguito di clamping ilare. Questa tecnica può essere facilmente appresa e riprodotta da personale con e senza esperienza microchirurgica, portando a risultati affidabili e coerenti e fungendo da modello ampiamente adottabile per lo studio dell'IRI polmonare.
L'IRI durante il trapianto d'organo è un importante fattore di rischio per la disfunzione primaria del trapianto e per i successivi episodi di rigetto del trapianto 1,2. Durante il trapianto, il tempo di ischemia calda è definito come il periodo di tempo che intercorre tra il cross-clamp dell'aorta del donatore e l'inizio della perfusione fredda e tra la rimozione dell'organo dal ghiaccio all'impianto dell'organo. Il tempo di conservazione a freddo è definito come il periodo di tempo che intercorre tra l'inizio della perfusione fredda e la rimozione dell'organo dal ghiaccio3. L'ischemia....
Tutti gli studi sono stati approvati dall'Institutional Animal Care and Use Committee della Washington University School of Medicine. Gli animali hanno ricevuto cure umane in conformità con la Guida per la cura e l'uso degli animali da laboratorio, 8aedizione 21 preparata dalla National Academy of Sciences e pubblicata dal National Institutes of Health, e i Principi di cura degli animali da laboratorio formulati dalla National Society for Medical Research.
Dopo il clamping ilare sinistro, la pressione parziale di ossigenazione nel sangue arterioso (PaO2) attribuita al polmone sinistro è di ~100 mmHg, significativamente più bassa rispetto ai ~500 mmHg dopo la toracotomia fittizia (Figura 7A, n=6-7). Da notare che sono state eseguite toracotomie fittizie in topi B6 con misurazione ABG presa dopo 4 minuti di clamping ilare destro, che rappresentano valori attribuiti al solo polmone sinistro. La colorazione H&E del polmone sinistro co.......
Descriviamo una tecnica di clamp ilare che prevede l'applicazione di un nodo scorsoio sull'ilo sinistro che occlude l'arteria polmonare e le vene e i bronchi per indurre l'ischemia calda seguita da riperfusione. Dopo il clampaggio ilare, il polmone sinistro può essere prelevato per una varietà di tecniche sperimentali come l'istologia, la citometria a flusso, il sequenziamento di massa o di singole cellule e la reazione quantitativa a catena della polimerasi. Inoltre, il sangue e la milza possono essere utilizzati per .......
Questo lavoro non ha ricevuto alcuna sovvenzione specifica da alcuna agenzia di finanziamento nei settori pubblico, commerciale o senza scopo di lucro.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Medications | |||
10% povidone-iodine solution | Aplicare | NDC 52380-0126-2 | For disinfectant |
Buprenorphine 1.3 mg/mL | Fidelis Animal Health | NDC 86084-100-30 | For pain control |
Carprofen | Cronus Pharma | NDC 69043-027-18 | For pain control |
Heparin 1000 units/mL | Sagent | NDC 25021-404-01 | For obtaining arterial blood |
Isoflurane 1%-1.5% | Sigma Aldrich | 26675-46-7 | For anesthesia |
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL | Vedco | NDC 50989-996-06 | For anesthesia |
Puralube Vet eye ointment | Medi-Vet.com | 11897 | To prevent eye dessiccation |
Xylazine 20 mg/mL | Akorn | NDC 59399-110-20 | For pain control |
Tools and Instruments | |||
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen | McKesson | 231 | To coagulate blood vessels |
Curved mosquito clamp | Fine Science Tools | 13009-12 | For surgical procedure |
Fine curved forceps | Fine Science Tools | 11274-20 | For surgical procedure |
Fine scissors | Fine Science Tools | 15040-11 | For surgical procedure |
Intubation clamp set-up | Fine Science Tools | 18374-44, 18144-30 | For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A. |
Magnetic rib retractors | Fine Science Tools | 18200-01, 18200-10 | For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below. |
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm | Edmund Optics | 02-532 | To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly. |
Power Pro Ultra clipper | Oster | 078400-020-001 | To clip hair |
Scissors | Fine Science Tools | 14370-22 | For surgical procedure |
Small animal heating pad | K&H Pet Products | Thermo-Peep Heated Pad | To maintain normothermia |
Small animal ventilator | Harvard Apparatus | 55-0000 | For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%) |
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter) | Amazon.com | https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1 | For retraction of thoracotomy |
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer | Nova Biomedical | https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB | For retraction of thoracotomy |
Straight clamp | Fine Science Tools | 13008-12 | For surgical procedure |
Straight forceps | Fine Science Tools | 91113-10 | For surgical procedure |
Surgical microscope | Wild Heerbrugg | no longer produced | For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes |
Supplies | |||
½ cc syringe with ½ inch 29G needle | McKesson | 942665 | For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally |
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe | McKesson | 16-SNT1C2705 | For aspiration of arterial blood from left ventricle |
1-inch 20G IV catheter | Terumo | SROX2025CA | For endotracheal tube (ETT) |
1-inch silk tape | Durapore | 3M ID 7100057168 | To tape ETT to nose and to secure limbs |
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle | McKesson | 102-SN310C31516P | For antibody injection into the inferior vena cava |
6-0 monofilament suture on a P-10 needle | McKesson | S697GX | For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin |
6-0 silk tie | Surgical Specialties Look | SP102 | To make slipknot for hilar clamp |
Pointed cotton-tipped applicators | Solon | 56225 | To manipulate lung and for blunt dissection |
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