Мышиная модель прикорневого зажима левой легочной артерии при реперфузионном повреждении ишемии легких

Summary

В протоколе изложен осуществимый, надежный и воспроизводимый метод пережатия левой легочной прикорневой мышцы, который может быть использован для изучения ишемии-реперфузионного повреждения легких на мышиных моделях.

Abstract

Ишемическое реперфузионное повреждение (ИРИ) во время трансплантации легкого является основным фактором риска посттрансплантационных осложнений, включая первичную дисфункцию трансплантата, острое и хроническое отторжение и смертность. Усилия по изучению основ IRI привели к разработке надежной и воспроизводимой модели прикорневой фиксации левого легкого у мышей. Эта модель включает в себя хирургическую процедуру, выполняемую у анестезируемой и интубированной мыши. Выполняется левая торакотомия с последующей тщательной мобилизацией легких и рассечением левого легочного воротка. Прикорневой зажим включает в себя обратимое наложение швов на ворота легочной артерии с помощью узла, который останавливает артериальный приток, венозный отток и поток воздуха через левый основной стволовой бронх. Реперфузия инициируется тщательным снятием швов. В текущих исследованиях наша лаборатория использует 30 мин ишемии и 1 ч реперфузии для экспериментальной модели. Однако эти временные периоды могут быть изменены в зависимости от конкретного экспериментального вопроса. Непосредственно перед жертвоприношением можно получить газ артериальной крови из левого желудочка после 4-минутного периода пережатия правой прикорневой мышцы, чтобы убедиться, что полученные значения PaO₂ относятся только к поврежденному левому легкому. Мы также описываем метод измерения экстравазации клеток с помощью проточной цитометрии, который включает внутривенное введение меченного флуорохромом антитела, специфичного для изучаемой клетки (клеток) перед жертвоприношением. Затем левое легкое может быть собрано для проточной цитометрии, замороженной или фиксированной, иммуногистохимии со встроенным парафином и количественной полимеразной цепной реакции. Этот метод прикорневого зажима позволяет детально изучить клеточные и молекулярные механизмы, лежащие в основе ИРИ. Репрезентативные результаты свидетельствуют о снижении оксигенации левого легкого и гистологических признаках повреждения легких после прикорневой пережатия. Эта техника может быть легко изучена и воспроизведена персоналом с опытом микрохирургии и без него, что приводит к надежным и стабильным результатам и служит широко используемой моделью для изучения ИРИ легких.

Introduction

ИРИ при трансплантации органов является основным фактором риска развития первичной дисфункции трансплантата и последующих эпизодов отторжения трансплантата ^1,2. Во время трансплантации время теплой ишемии определяется как период времени от перекрестного зажима донорской аорты до начала холодной перфузии и от извлечения органа изо льда до имплантации органа. Время хранения в холодильнике определяется как период времени от начала холодной перфузии до извлечения органа изо льда³. Теплая ишемия более вредна для последующей функции органов, чем холодовая ишемия ^4....

Protocol

Все исследования были одобрены Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Медицинской школе Вашингтонского университета. Животные получали гуманный уход в соответствии с Руководством по уходу за лабораторными животными и их использованию,^8-е издан?.......

Discussion

Мы описываем технику прикорневого зажима, которая включает в себя наложение узла на левом вороте, который окклюзирует легочную артерию и вены и бронх, чтобы вызвать теплую ишемию с последующей реперфузией. После прикорневой пережатости левое легкое может быть собрано для различных эк?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Medications
10% povidone-iodine solution	Aplicare	NDC 52380-0126-2	For disinfectant
Buprenorphine 1.3 mg/mL	Fidelis Animal Health	NDC 86084-100-30	For pain control
Carprofen	Cronus Pharma	NDC 69043-027-18	For pain control
Heparin 1000 units/mL	Sagent	NDC 25021-404-01	For obtaining arterial blood
Isoflurane 1%-1.5%	Sigma Aldrich	26675-46-7	For anesthesia
Ketamine hydrochloride 100 mg/mL	Vedco	NDC 50989-996-06	For anesthesia
Puralube Vet eye ointment	Medi-Vet.com	11897	To prevent eye dessiccation
Xylazine 20 mg/mL	Akorn	NDC 59399-110-20	For pain control
Tools and Instruments
Argent High Temp Fine Tip Cautery Pen	McKesson	231	To coagulate blood vessels
Curved mosquito clamp	Fine Science Tools	13009-12	For surgical procedure
Fine curved forceps	Fine Science Tools	11274-20	For surgical procedure
Fine scissors	Fine Science Tools	15040-11	For surgical procedure
Intubation clamp set-up	Fine Science Tools	18374-44, 18144-30	For holding mouse vertically by the tongue during intubation. See Supplementary Figure 1A.
Magnetic rib retractors	Fine Science Tools	18200-01, 18200-10	For retraction of thoracotomy. Magnetic fixator and retractor should be connected by micro latex tubing below.
Optical Grade Plastic Optical Fiber Unjacketed, 500μm	Edmund Optics	02-532	To make the introducer for the endotracheal tube. See Supplemental Figure 1B. A 1.5-inch length of this optical fiber should have a piece of silk tape secured to one end. It can then be used as an introducer for the endotracheal tube. The end of the introducer should be curves slightly.
Power Pro Ultra clipper	Oster	078400-020-001	To clip hair
Scissors	Fine Science Tools	14370-22	For surgical procedure
Small animal heating pad	K&H Pet Products	Thermo-Peep Heated Pad	To maintain normothermia
Small animal ventilator	Harvard Apparatus	55-0000	For ventilation (TV 0.35 cc, PEEP 1 cm H2O, RR 100-105/min, FiO2 100%)
Spearit Micro Latex Rubber Tubing (1/8 in outside diameter, 1/16 in inside diameter)	Amazon.com	https://www.amazon.com/Rubber-Tubing-CONTINUOUS-Select-Length/dp/B00H4MT7V0?th=1	For retraction of thoracotomy
Stat Profile Prime Critical Care Blood Gas Analyzer	Nova Biomedical	https://novabiomedical.com/prime-plus-critical-care-blood-gas-analyzer/index.php?gad=1&gclid=Cj0KCQjwmICoBhDx ARIsABXkXlInZX--R3ezBkc304nS_GVGI9Z2T3Esr33 2aM8WGPiUVhicPQZ Wj2AaAqhDEALw_wcB	For retraction of thoracotomy
Straight clamp	Fine Science Tools	13008-12	For surgical procedure
Straight forceps	Fine Science Tools	91113-10	For surgical procedure
Surgical microscope	Wild Heerbrugg	no longer produced	For intubation and surgical procedure; recommend replacement with Leica surgical microscopes
Supplies
½ cc syringe with ½ inch 29G needle	McKesson	942665	For injecting ketamine/xylazine intraperitoneally
½ inch 31G needle on a 1 cc tuberculin syringe	McKesson	16-SNT1C2705	For aspiration of arterial blood from left ventricle
1-inch 20G IV catheter	Terumo	SROX2025CA	For endotracheal tube (ETT)
1-inch silk tape	Durapore	3M ID 7100057168	To tape ETT to nose and to secure limbs
3/10 cc syringe with 5/16 inch 31G needle	McKesson	102-SN310C31516P	For antibody injection into the inferior vena cava
6-0 monofilament suture on a P-10 needle	McKesson	S697GX	For closure of thoracotomy, muscle layer, and skin
6-0 silk tie	Surgical Specialties Look	SP102	To make slipknot for hilar clamp
Pointed cotton-tipped applicators	Solon	56225	To manipulate lung and for blunt dissection