В этом протоколе описывается полуавтоматизированный способ повышения эффективности и возможностей обработки и криоконсервации спермы кораллов, находящихся под угрозой исчезновения, с целью обеспечения генетического разнообразия и поддержки усилий по восстановлению рифов.
Коралловые рифы сталкиваются с кризисом, поскольку частота обесцвечивания, вызванного потеплением океана, увеличивается, что приводит к гибели кораллов на рифах по всему миру. Последующая утрата генетического разнообразия и биоразнообразия может снизить способность кораллов адаптироваться к изменяющемуся климату, поэтому усилия по сохранению существующего разнообразия имеют важное значение для максимального использования ресурсов, доступных для восстановления рифов сейчас и в будущем. Наиболее эффективным подходом к обеспечению безопасности генетики в долгосрочной перспективе является криоконсервация и биобанкинг, которые позволяют хранить живые образцы в замороженном виде при криогенных температурах в жидком азоте на неопределенный срок. Криоконсервация спермы кораллов возможна с 2012 года, но сезонный характер размножения кораллов означает, что деятельность биобанков ограничена всего несколькими ночами в году, когда происходит нерест. Таким образом, повышение эффективности процессов обработки спермы кораллов и криоконсервации имеет важное значение для максимального использования этих ограниченных возможностей биобанкинга. С этой целью мы поставили перед собой задачу оптимизировать процессы криоконсервации коралловой спермы, опираясь на существующие технологии и создав полуавтоматизированный подход к оптимизации оценки, обработки и криоконсервации коралловой спермы. Процесс, который сочетает в себе компьютерный анализ спермы, криовиальные штрих-коды и серию связанных автоматических таблиц данных для одновременного редактирования несколькими пользователями, повышает эффективность как обработки образцов, так и управления метаданными в полевых условиях. Благодаря интеграции с межсекторальными исследовательскими программами, такими как Программа восстановления рифов и адаптации в Австралии, криоконсервация может играть решающую роль в крупномасштабных программах восстановления рифов, способствуя генетическому управлению популяциями аквакультуры, поддерживая исследования по повышению термоустойчивости и предотвращая вымирание видов кораллов. Описанные процедуры будут использоваться практиками криоконсервации кораллов и биобанкинга на рифах по всему миру и послужат моделью для перехода технологий криоконсервации от исследовательских лабораторий к крупномасштабным приложениям.
Коралловые рифы во всем мире испытывают потерю коралловых видов, популяций и генетического разнообразия из-за потепления и закисления океана, вызванного изменением климата, что снижает жизнеспособность этих критически важных мест обитания и влияет на виды, которые они поддерживают. Наиболее эффективным подходом к обеспечению безопасности генетики в долгосрочной перспективе является криоконсервация и биобанкинг, которые позволяют хранить живые образцы в замороженном виде при криогенных температурах в жидком азотена неопределенный срок3. Разработка в 2012 году методов криоконсервации спермы кораллов4 впервые позволила создать биобанк генетики этих видов и привела к созданию первого биорепозитория для генетики кораллов в 2012году5. С тех пор этот протокол криоконсервациибыл усовершенствован и использован для обеспечения генетики более 50 видов кораллов во всем мире, причем 30 из этих видов происходят из Большого Барьерного рифа в Австралии7. Криоконсервированная коралловая сперма может генерировать здоровые кораллы, которые развиваются нормально и используются для облегчения экспериментов по ассистированному потоку геновв Австралии 8 и Карибском бассейне9. В то время как в настоящее время разрабатываются технологии, позволяющие криоконсервировать сложные типы тканей, такие как личинки10 и взрослые коралловые ткани11,12, криоконсервация коралловой спермы в настоящее время является наиболее распространенным доступным инструментом для рутинного биобанкинга генетики кораллов.
По мере того, как воздействие на популяции кораллов увеличивается, некоторые страны инициировали крупномасштабные программы по поддержке восстановления рифов и адаптации к ним (например, Программа восстановления и адаптации рифов [RRAP] в Австралии13) или по сохранению оставшихся популяций кораллов, находящихся под угрозой исчезновения (например, Florida Coral Rescue в США14). В контексте этих программ криоконсервацию можно рассматривать как технологию, способствующую проведению исследований и крупномасштабному производству кораллов в дополнение к сохранению существующего генетического разнообразия и предотвращению вымирания. Криоконсервация спермы может обеспечить больший контроль над размножением между популяциями, которые физически или временно разделены, и может позволить генетическому управлению маточного стада отбирать желаемые признаки, такие как термическая толерантностьили устойчивость к болезням. На сегодняшний день биобанкинг коралловой спермы осуществляется в относительно небольших масштабах вподдержку управления биоразнообразием7, поэтому потребуется некоторый уровень масштабирования, если такой биобанкинг хочет реализовать свой потенциал в рамках этих более крупных программ восстановления рифов. Как и в случае со всеми усилиями по восстановлению рифов, основанными на воспроизводстве кораллов, основным препятствием для увеличения усилий по биобанкингу является ограниченный период, в течение которого коралловые гаметы доступны, поскольку нерест у большинства рифообразующих видов совпадает с полнолунием в конце весны иначале лета, а это означает, что гаметы доступны для криоконсервации и биобанкинга только несколько ночей в году. Более того, в регионах, где происходит массовый нерест, например, на Большом Барьерном рифе, как правило, несколько видов нерестятся одновременно или с интервалом в несколько часов водну и ту же ночь. Таким образом, требуется усовершенствование пути криоконсервации спермы для увеличения масштаба и эффективности обработки для максимального увеличения емкости биобанка в течение этих коротких ежегодных нерестовых окон при одновременном обеспечении целостности образцов и связанных с ними метаданных.
Криоконсервация и биобанкинг спермы кораллов включают в себя несколько ключевых этапов, от сбора гамет во время нереста до поступления образцов в биорепозиторий и базу данных (рис. 1). Процесс начинается с отделения сперматозоидов от яйцеклеток (у гермафродитных видов) или сбора сперматозоидов из толщи воды (у гонохорных видов) с последующей оценкой подвижности и концентрации сперматозоидов. Затем сперматозоиды смешивают с криопротектором (конечная концентрация 10% v/v, диметилсульфоксид, ДМСО) в отфильтрованной морской воде (FSW) и охлаждают до −20 °C/мин в специально разработанном охлаждающем устройстве4. Ранние итерации этого процесса основывались на визуальной оценке подвижности и концентрации сперматозоидов с помощью фазово-контрастной микроскопии и подсчета гемоцитометров, печати и маркировки пробирок при обработке образцов для криоконсервации, ручном пипетировании образцов спермы в криовиалы и охлаждении на специально разработанном плавающем штативе16. Применение компьютерного анализа спермы (CASA)17 и разработка напечатанного на 3D-принтере охлаждающегоустройства повысили эффективность и надежность криоконсервации спермы кораллов, но процесс обработки образцов спермы остался в основном неизменным с момента его создания. Несмотря на то, что этот подход подходит для обработки образцов от умеренного числа колоний и видов в ночь нереста, для больших объемов и количества колоний (например, отдельных образцов от >10 колоний одновременно) существуют узкие места в пути криоконсервации, которые препятствуют своевременной обработке образцов (т.е. в течение 2 ч после высвобождения спермы) без ухудшения потенциала фертильности образца. Несмотря на то, что существуют крупномасштабные системы работы с жидкостями для криовалиальных камер (например, Thomas et al.18), они, как правило, предназначены для обработки больших партий (т.е. нескольких штативов криовиалов) и не подходят для транспортировки и использования в полевых условиях, поэтому они не являются экономически эффективными для данного применения. Таким образом, настоящее исследование было направлено на повышение эффективности криоконсервации спермы кораллов путем внедрения портативного, недорогого оборудования и методов автоматизации на ключевых этапах процесса обработки, чтобы максимизировать количество образцов, которые могут быть эффективно криоконсервированы в ночь нереста.
Описанные здесь способы могут быть использованы для обработки и криоконсервации спермы как гермафродитных, так и гонохорных видов кораллов. Общее введение и учебник по нересту кораллов и сбору гамет для криоконсервации спермы для обоих репродуктивных режимов можно найти в Смитсоновском национальном зоопарке и Институте биологии охраны кораллов19. Описанные методы были разработаны в первую очередь с использованием гамет из колоний Acropora millepora , собранных в группе островов Кеппель в море Воппабурра и на рифе Дэвис в море Биндал на Большом Барьерном рифе в Австралии. Весь сбор и использование кораллов и гамет осуществлялись со свободного, предварительного и информированного согласия традиционных хранителей соответствующих стран моря. Реагенты и оборудование, использованные для данного исследования, перечислены в Таблице материалов.
1. Преднерестовая подготовка - проверка системы и приготовление раствора активации сперматозоидов и криодилюента
2. Подготовка и оценка спермы
3. Разбавление сперматозоидов и уравновешивание криопротекторов
Концентрация сперматозоидов | Криодилюент | Соотношение разведения (сперма:криодилюент) | Конечная концентрация ДМСО в образце спермы (%) |
< 2 × 109/мл | 30% ДМСО в FSW | 2:1 | 10% |
≥ 2 × 109/мл | 20% ДМСО в FSW | 1:1 | 10% |
Таблица 1: Концентрация криодилюента и коэффициенты разбавления для криоконсервации спермы кораллов, основанные на оценке общей концентрации сперматозоидов в образце, подлежащем криоконсервации.
4. Криоконсервация спермы
Шаги, описанные в этом протоколе, основаны на оригинальных методах криоконсервации коралловой спермы, описанных Hagedorn et al.4 и последующем усовершенствовании Zuchowicz et al.6, обеспечивая ключевые улучшения для повышения эффективности обработки спермы для криоконсервации и биобанкинга. Использование криовиалов со штрих-кодами и автопипеттора с аликвотированием упрощает процедуру упаковки спермы, устраняя необходимость печатать и вручную маркировать криовиалы, а также снижает нагрузку при ручном пипетировании большого количества образцов. Важно отметить, что эти усовершенствования также сокращают время, необходимое для подготовки образцов для криоконсервации, примерно с 8-10 минут до менее чем 5 минут. Вместе с использованием CASA, эти усовершенствования сокращают количество персонала, необходимого для эффективного биобанкинга спермы кораллов, с 4 до 6 в оригинальных методах до всего двух человек, использующих текущий протокол. Кроме того, использование криовиалов со штрих-кодами означает, что каждая пробирка имеет уникальный идентификатор, поэтому каждую пробирку можно отслеживать в базе данных с более высоким разрешением, чем при предыдущем методе, с использованием этикеток, напечатанных партиями.
Полевые испытания протокола на двух нерестовых мероприятиях во время нерестового сезона на Большом Барьерном рифе 2022 года в Австралии привели к криоконсервации и биобанковскому хранению 389 образцов из 57 колоний 5 видов двумя операторами (один человек для CASA, один человек для криоконсервации), при этом еще один человек помогал в разбивании пучков и отделении сперматозоидов по мере необходимости. Во время нереста в ноябре 2022 года на острове Кономи (остров Северный Кеппел) в Квинсленде, Австралия, два оператора в течение 2 часов крионировали 150 образцов из 24 колоний Acropora millepora . Эффективная обработка и криоконсервация такого объема образцов из такого большого количества коралловых колоний стала возможной в первую очередь благодаря эффективности времени подготовки образцов и упрощенной передаче метаданных между рабочими станциями.
Дальнейшее тестирование рабочего процесса во время нереста в декабре 2023 года показало, что для спермы кораллов счетная камера Маклера обеспечивает более точные данные о подвижности и концентрации по сравнению с коммерчески доступными одноразовыми предметными стеклами с фиксированным покровным стеклопакетом, обычно используемыми с системами CASA. Счетная камера Маклера была валидирована для CASA с использованием коммерчески доступных латексных микрогранул в известной концентрации с объемом образца 4 мкл и стандартными настройками CASA17 , используемыми для коралловой спермы. Эти анализы показали стабильные подсчеты с низкой вариабельностью (44,5 ± 0,7 млн/мл), которые находились в пределах ожидаемого диапазона концентраций (46,0 ± 7,0 млн/мл), предоставленного производителем (рис. 2). Сравнение данных CASA для Acropora millepora, собранных с использованием счетной камеры Маклера и предметных стекол с фиксированным покровным стеклопакетом, показало значительную разницу в подсчетах концентраций сперматозоидов между двумя типами камер (P = 0,002; Рисунок 2), при этом предметные стекла камеры с фиксированным покровным стеклом регистрируют менее половины концентрации, определенной с помощью счетной камеры Маклера. Эта тенденция также наблюдалась в образцах спермы двух других видов кораллов (данные не показаны). Тестирование в декабре 2023 года также не выявило существенной разницы в концентрациях после размораживания общих, подвижных или постепенно подвижных сперматозоидов в образцах, криоконсервированных с использованием разведения 1:1 с 20% ДМСО или разведения 1:2 (сперма: криодилюент) с 30% ДМСО (Рисунок 3).
Рисунок 1: Рабочий процесс, используемый для полуавтоматической обработки спермы кораллов для криоконсервации, и примеры мобильного оборудования, используемого в полевых условиях. (A) Пучки коралловых гамет собираются в соотношении 5 мл пучков на 5 мл FSW и разбиваются на отдельные яйцеклетки и сперматозоиды (i). Метаданные колонии вносятся в автотаблицу данных (ii), а изолированный образец спермы оценивается с помощью компьютерного анализа спермы (CASA) (iii). Параметры качества спермы добавляются в автотаблицу для расчета добавления 20% или 30% ДМСО в FSW (iv), и разведенный образец аликвотируется в криовиалы со штрих-кодом (v). Криографические аппараты загружаются на криоштатив и сканируются в автотехническом описании (vi), а затем охлаждаются со скоростью от −20 °C/мин до −80 °C (vii). Затем образцы закаливаются в жидком азоте и передаются сухим грузам для транспортировки в Банк криоразнообразия Таронга (viii). (B) Пример станций CASA (слева) и криоконсервации (справа), установленных на удаленном полевом участке в классе Центра экологического образования «Кономие». (C) Пример лабораторной высокопроизводительной станции криоконсервации, созданной для работы нескольких криостелей в Национальном морском симуляторе Австралийского института морских наук. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Сравнение двух различных вариантов предметных стекол для измерения концентрации сперматозоидов кораллов . (A) Сравнение измерений общей концентрации сперматозоидов у Acropora millepora (n = 3 особей) с использованием счетной камеры Маклера и коммерчески доступных стационарных предметных стекол. В столбцах указано среднее значение ± СЕМ; звездочки указывают на существенную разницу (P = 0,002). (B) Валидация счетной камеры Маклера с использованием коммерчески доступных латексных микрогранул в известной концентрации и стандартных настройках CASA для коралловой спермы. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Концентрации после размораживания общих, подвижных или прогрессивно подвижных сперматозоидов в криоконсервированных образцах. Сравнение после размораживания общих, подвижных и прогрессивно подвижных концентраций сперматозоидов с использованием 20% или 30% ДМСО в FSW для достижения конечной концентрации ДМСО в 10% для криоконсервации. Образцы от n = 3 особей были разделены на 2 аликвоты каждая, при этом одна аликвота была криоконсервирована с добавлением 20% ДМСО в соотношении 1:1, а вторая аликвота была разведена до <2 × 109/мл с использованием FSW для криоконсервации с добавлением 1:2 (сперма: криодилюент) 30% ДМСО. В столбцах указано среднее значение ± SEM. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этого рисунка.
Дополнительный файл 1: Файл автоматического технического описания биобанка Coral. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы загрузить этот файл.
Полуавтоматизированный процесс обработки, описанный в этом протоколе, позволяет эффективно обрабатывать и криоконсервировать сперму кораллов для получения генетики от видов, находящихся под угрозой исчезновения, и поддержки усилий по восстановлению и адаптации рифов. Мотивацией для разработки данного протокола послужило отсутствие существующих систем, отвечающих требованиям к пропускной способности криоконсервации коралловой спермы и использованию криоконсервации, поскольку высокопроизводительные системы обработки для криоконсервации спермы обычно основаны на упаковке образцов во французские соломинки объемом 0,25 мл или 0,5 мл21,22. Для сравнения, криовиалы обычно используются либо в небольших масштабах для обработки с низкой пропускной способностью (например, криоконсервация лабораторных образцов для исследований23,24), либо в высокопроизводительных системах обработки объемных образцов с использованием дорогостоящего непортативного оборудования (например, обработка клеточных культур для промышленности18,25). Мы также исследовали потенциал использования системы автоматического удаления кап для упрощения снятия и замены криовиальных колпачков, но системы были доступны только для отдельных криовиальных колпачков или для целых криовиальных стоек, поэтому они не представляли собой экономически эффективного решения. В настоящее время в мире существует несколько групп, которые используют протокол криоконсервации, разработанный Хагедорном и соавторами, для обеспечения генетического разнообразия кораллов, и важно, чтобы эта работа продолжала распространяться на большее количество рифов по всему миру. Таким образом, основным соображением при разработке настоящего протокола была необходимость использования экономически эффективных и доступных технологий, которые могли бы быть легко внедрены этими другими группами и которые не были бы непомерно дорогостоящими для новых групп, желающих начать криоконсервацию коралловой спермы.
Ключевым компонентом описанного протокола является улучшенная обработка образцов метаданных с помощью связанных электронных таблиц в Microsoft Excel. Ввод данных, как правило, прост, но следует отметить, что редактирование информации в автоматических таблицах должно выполняться только путем удаления и повторного ввода информации, так как быстрые функции (например, Ctrl + C, Ctrl + V) для редактирования данных потенциально могут повлиять на одновременный ввод данных другими пользователями и могут вызвать проблемы со связыванием данных между электронными таблицами. Важным компонентом метаданных является уникальный идентификатор (а именно идентификатор колонии), который связан с донорской колонией и прикрепляется к образцу на всех этапах пути обработки. Важно, чтобы пробирки с образцами были четко помечены идентификатором колонии во время сбора пучка, и чтобы эта информация была точно переписана на любых новых пробирках, в которые образец переносится во время подготовки (например, во время фильтрации для разделения яйцеклеток и сперматозоидов или для добавления криодилюента). Несмотря на то, что протокол обеспечивает автоматическую передачу информации о качестве образца от оператора CASA на рабочую станцию криоконсервации, проблемы могут возникать при плохом покрытии Интернета или Wi-Fi. При возникновении задержек при передаче данных рекомендуется, чтобы обе рабочие станции работали в автономном режиме и поддерживали отдельные автоматические даташиты, которые впоследствии можно согласовать. Ключевой информацией, требуемой оператором криоконсервации, является идентификатор колонии и концентрация образца, поэтому рекомендуется, чтобы оператор CASA записал концентрацию образца в пробирке с образцом в качестве резервной копии, чтобы гарантировать, что эта информация будет под рукой для подготовки к криоконсервации в случае задержки в загрузке или скачивании метаданных между компьютерами.
Выбор сканера штрих-кода и криовиалов со штрих-кодом, используемых для этого протокола, может варьироваться в зависимости от бюджета и доступности продукта; Тем не менее, есть некоторые ключевые элементы, которые следует учитывать при их выборе. Сканер штрих-кодов должен иметь возможность пользовательских настроек, в частности, возможность изменения спецификаций ввода данных и направления ввода данных. В автоматических даташитах, используемых для этого протокола, используется горизонтальный ввод, но в некоторых случаях (например, при вступлении в биобанк или для других лабораторных целей) может потребоваться вертикальный ввод, поэтому важно, чтобы эта функция была настраиваемой. Несмотря на то, что протокол может использоваться как с 1D, так и с 2D штрих-кодами, рекомендуется, чтобы выбранные криографические коды имели человекочитаемый компонент (например, 1D штрих-коды обычно включают уникальный номер), чтобы обеспечить перекрестную проверку ввода образца во время криоконсервации. В дополнение к вводу образцов, сканер штрих-кодов может использоваться для автоматизации ввода некоторых полей метаданных путем создания и распечатки QR-кодов для информации, которая повторяется в образцах (например, названия видов, даты и местоположения рифов) до начала нереста. Затем эту информацию можно быстро и легко ввести в автоматические спецификации путем сканирования с помощью сканера штрих-кодов. Кроме того, прикрепляя штрих-коды с серийными номерами к каждой криостойке и термопарному зонду, можно также связать каждый цикл криоконсервации с определенным набором оборудования в базе данных, что полезно для контроля качества и выявления компонентов, требующих ремонта или замены.
Ограничивающими факторами при обработке часто являются время, затраченное на ожидание распада пучков, и время, необходимое для фильтрации и отделения сперматозоидов от яйцеклеток до CASA и криоконсервации. По возможности рекомендуется обрабатывать образцы в том порядке, в котором пучки распадаются; Тем не менее, дальнейшее повышение эффективности может быть достигнуто за счет стратегического управления заказами на обработку образцов. Например, если на одну колонию приходится 5 или менее криодилюентов из-за малого объема образца (т.е. менее 3 мл сперматозоидов на колонию) или низкой концентрации сперматозоидов, требующей разведения криодилюентом в соотношении 2:1 (т.е. менее 2 × 109/мл), то лучше добавить криодилюент в два образца колонии одновременно, чтобы их можно было запустить вместе на одной криостойке (всего # доступных слотов = 11), вместо того, чтобы запускать их отдельно с манекенами, заполняющими пустые места. Кроме того, можно одновременно запускать несколько криоштативных аппаратов (для образцов объемом >6 мл) при условии, что все процессы могут быть завершены в течение 10-минутного времени уравновешивания криодилюента, что может еще больше увеличить производительность образца. Тем не менее, при использовании нескольких криостендов или объединении нескольких колоний на одном криостенде необходимо позаботиться о том, чтобы метаданные криоконсервации были назначены правильному образцу в автоматической даташите, особенно если образцы крионируются в порядке, отличном от их оценки CASA.
В дополнение к разработке полуавтоматизированного рабочего процесса, настоящее описание протокола также содержит два методологических сравнения, связанных с концентрацией сперматозоидов, которые направлены на улучшение анализа спермы и результатов криоконсервации. Как правило, сбор 5 мл пучков гамет на 5 мл морской воды (общий объем 10 мл) приведет к концентрации сперматозоидов на уровне или выше 2 × 109 клеток/мл, но бывают случаи, когда концентрация сперматозоидов может быть ниже из-за видовых различий или разрыва пучков во время сбора. Использование криодилюента ДМСО в более высокой концентрации (30% v/v) снижает количество разбавленных сперматозоидов, что помогает свести к минимуму колебания концентрации сперматозоидов в криовиальной камере от партии к партии. Важно отметить, что использование 30% ДМСО для достижения конечной концентрации ДМСО не влияет на параметры концентрации или подвижности после оттаивания, как показано репрезентативными данными на рисунке 3. Второе методологическое сравнение представляет собой альтернативу одноразовым предметным стеклам с фиксированным покровным стеклом, обычно используемым в CASA. Основная проблема с использованием коммерчески доступных предметных стекол для анализа спермы кораллов заключается в том, что они могут повлиять на точность оценки подвижности из-за прилипания сперматозоидов к покрытию предметного стекла. Использование решения для активации позволяет решить эту проблему во многих, но не во всех образцах, поэтому по-прежнему рекомендуется выполнять отдельный анализ CASA на подвижность с использованием простого предметного стекла для обеспечения надежности и согласованности. Использование счетной камеры Маклера устраняет необходимость анализа концентрации и подвижности по отдельности и потенциально повышает точность измерений концентрации (рис. 2), поэтому рекомендуется для использования с текущим протоколом. Учитывая это расхождение в измерениях концентрации, о которомсообщалось ранее, важно всегда записывать детали предметного стекла в базу данных вместе с данными о качестве спермы и, по возможности, быть последовательным в выборе типа используемого предметного стекла камеры, чтобы свести к минимуму вариации от партии к партии и обеспечить надежные расчеты соотношения сперматозоидов и яйцеклеток для оплодотворения.
Описанный в настоящем документе полуавтоматический процесс обеспечивает стандартизированный и эффективный путь криоконсервации и биохранения спермы из находящихся под угрозой исчезновения видов кораллов при сохранении биобезопасности и качества образца. Описанный протокол легко переносится и относительно недорог для реализации в программах по всему миру, которые работают над обеспечением существующего разнообразия кораллов с использованием криоконсервации, что будет иметь важное значение для предотвращения вымирания и максимизации ресурсов, доступных для усилий по восстановлению рифов сейчас и в будущем.
Авторы сообщают, что нет никаких конкурирующих интересов, о которых можно было бы заявить.
Мы благодарим традиционных владельцев Кономие, народ воппабурра, за разрешение опробовать систему, описанную в этом документе, во время нереста на территории страны в ноябре 2022 года, а также Центр экологического образования Кономие за использование их объектов. Мы также хотели бы выразить признательность за поддержку сотрудникам и ученым Австралийского института морских наук, которые способствовали сбору и нересту колоний в рамках Национального морского симулятора. Эта работа была проведена в рамках подпрограммы «Криоконсервация» (RRAP-CP-01) в рамках Программы восстановления и адаптации рифов, партнерства между Фондом рифов правительства Австралии и Фондом Большого Барьерного рифа, при дополнительной поддержке Австралийского общества охраны природы таронга, Научной инициативы по сохранению таронга и других филантропов, поддерживающих Фонд Таронга.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller - Aliquotting pipette | Vistalab | 2100-1005 | Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials |
5 mL serological pipettes (bulk) | Thermo Scientific | Nunc 170355 | Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials |
10 mL serological pipettes (bulk) | Thermo Scientific | Nunc 170356 | Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials |
P2 0.2–2 µL pipettor | Gilson | F144054M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
P10 1–10 µL pipettor | Gilson | F144055M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
P20 2–20 µL pipettor | Gilson | F144056M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
P200 20–200 µL pipettor | Gilson | F144058M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
P1000 100–1000 µL pipettor | Gilson | F144059M | Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment |
Vacuum pump | Millipore | WP6122050 | Preparation of filtered sea water for solution preparation |
Reusable bottle-top filtration system | Thermo Scientific | DS0320-5045 | Preparation of filtered sea water for solution preparation |
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters | Merck Millipore | GSWP04700 | Preparation of filtered sea water for solution preparation |
Filtered sea water | N/A | – | Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions |
Dimethyl sulfoxide (DMSO) | Sigma-Aldrich | D4540 | Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation |
Caffeine | Sigma-Aldrich | C0750 | Used to activate sperm motility |
BSA heat shock fraction | Sigma-Aldrich | A9647 | Used to minimise sperm adherance to CASA well slides |
15-mL tubes - racked | Thermo Scientific | 339651 | Preparation of sperm activation solution |
50-mL tubes racked | Thermo Scientific | 339653 | For collection of gamete bundles and filtered sperm samples |
Transfer pipettes | Thermo Scientific | Samco 202PK | To aid collection of gamete bundles from the water surface |
100-µm filter baskets | Fisher Scientific | 22363549 | To exclude eggs during separation of the sperm sample |
Eppendorf racks | Interpath | 511029 | Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment |
Eppendorf 1.5-mL tube | Eppendorf | 30120086 | Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment |
Glass coverslips 18x18 mm | Brand | 4700 45 | Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy |
Plain glass slides, precleaned, 75x25 mm | Corning | 2947 | Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy |
Haemocytometer | Hausser Scientific | 1492 | Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy |
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B) | IMV Technologies | 025107 | Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
Makler sperm counting chamber (CASA) | IVFStore | SM-373 | Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
accu-bead® counting beads | Hamilton-Thorne | 710111 | Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
CASA system + laptop | Hamilton Thorne | Ceros II | Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA) |
Safety Glasses | Generic | – | Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen |
Lab coat | Long sleeve, full length | – | Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen |
Cryogloves (pair) | Tempshield | Mid-Arm | Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen |
Medium forceps | Generic | – | For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen |
Barcode scanner (2D compatible) | Zebra | DS2278 | For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management |
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable | Eppendorf | 30079434 | Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples |
Cryovial rack | Simport | T315 | Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping |
Freezing racks | Custom | – | Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
Freezing rack lid | Custom | – | Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container | Isosteel | VA-9683 | Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005) |
Lab timers | Generic | – | For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation |
Nitrogen bath 9L | BelArt | M16807-9104 | For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling |
Thermocouple data logger- multichannel | Omega | HH520 | Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point |
Thermocouple probe – Type K | Omega | 5SC-TT-K-30-36 | Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point |
Cryo pens/coloured permanent pen | Staedtler Lumocolor | 318 | Optional for marking cryovial lids to assist with sample management |
Dry Shipper - charged | Taylor Wharton | CXR100, or CX500 | For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved