Полуавтоматизированный рабочий процесс криоконсервации спермы кораллов для поддержки биобанкинга и аквакультуры

Summary

В этом протоколе описывается полуавтоматизированный способ повышения эффективности и возможностей обработки и криоконсервации спермы кораллов, находящихся под угрозой исчезновения, с целью обеспечения генетического разнообразия и поддержки усилий по восстановлению рифов.

Abstract

Коралловые рифы сталкиваются с кризисом, поскольку частота обесцвечивания, вызванного потеплением океана, увеличивается, что приводит к гибели кораллов на рифах по всему миру. Последующая утрата генетического разнообразия и биоразнообразия может снизить способность кораллов адаптироваться к изменяющемуся климату, поэтому усилия по сохранению существующего разнообразия имеют важное значение для максимального использования ресурсов, доступных для восстановления рифов сейчас и в будущем. Наиболее эффективным подходом к обеспечению безопасности генетики в долгосрочной перспективе является криоконсервация и биобанкинг, которые позволяют хранить живые образцы в замороженном виде при криогенных температурах в жидком азоте на неопределенный срок. Криоконсервация спермы кораллов возможна с 2012 года, но сезонный характер размножения кораллов означает, что деятельность биобанков ограничена всего несколькими ночами в году, когда происходит нерест. Таким образом, повышение эффективности процессов обработки спермы кораллов и криоконсервации имеет важное значение для максимального использования этих ограниченных возможностей биобанкинга. С этой целью мы поставили перед собой задачу оптимизировать процессы криоконсервации коралловой спермы, опираясь на существующие технологии и создав полуавтоматизированный подход к оптимизации оценки, обработки и криоконсервации коралловой спермы. Процесс, который сочетает в себе компьютерный анализ спермы, криовиальные штрих-коды и серию связанных автоматических таблиц данных для одновременного редактирования несколькими пользователями, повышает эффективность как обработки образцов, так и управления метаданными в полевых условиях. Благодаря интеграции с межсекторальными исследовательскими программами, такими как Программа восстановления рифов и адаптации в Австралии, криоконсервация может играть решающую роль в крупномасштабных программах восстановления рифов, способствуя генетическому управлению популяциями аквакультуры, поддерживая исследования по повышению термоустойчивости и предотвращая вымирание видов кораллов. Описанные процедуры будут использоваться практиками криоконсервации кораллов и биобанкинга на рифах по всему миру и послужат моделью для перехода технологий криоконсервации от исследовательских лабораторий к крупномасштабным приложениям.

Introduction

Коралловые рифы во всем мире испытывают потерю коралловых видов, популяций и генетического разнообразия из-за потепления и закисления океана, вызванного изменением климата, что снижает жизнеспособность этих критически важных мест обитания и влияет на виды, которые они поддерживают^. Наиболее эффективным подходом к обеспечению безопасности генетики в долгосрочной перспективе является криоконсервация и биобанкинг, которые позволяют хранить живые образцы в замороженном виде при криогенных температурах в жидком азоте^{на неопределенный} срок3. Разработка в 2012 году методов криоконсервации спермы кораллов⁴ впервые позволила создать биобанк генетики этих видов и привела к созданию первого биорепозитория для генетики кораллов в 2012^году5. С тех пор этот протокол криоконсервации^{был усовершенствован и} использован для обеспечения генетики более 50 видов кораллов во всем мире, причем 30 из этих видов происходят из Большого Барьерного рифа в Австралии⁷. Криоконсервированная коралловая сперма может генерировать здоровые кораллы, которые развиваются нормально и используются для облегчения экспериментов по ассистированному потоку генов^{в Австралии 8} и Карибском бассейне⁹. В то время как в настоящее время разрабатываются технологии, позволяющие криоконсервировать сложные типы тканей, такие как личинки¹⁰ и взрослые коралловые ткани^11,12, криоконсервация коралловой спермы в настоящее время является наиболее распространенным доступным инструментом для рутинного биобанкинга генетики кораллов.

По мере того, как воздействие на популяции кораллов увеличивается, некоторые страны инициировали крупномасштабные программы по поддержке восстановления рифов и адаптации к ним (например, Программа восстановления и адаптации рифов [RRAP] в Австралии¹³) или по сохранению оставшихся популяций кораллов, находящихся под угрозой исчезновения (например, Florida Coral Rescue в США¹⁴). В контексте этих программ криоконсервацию можно рассматривать как технологию, способствующую проведению исследований и крупномасштабному производству кораллов в дополнение к сохранению существующего генетического разнообразия и предотвращению вымирания. Криоконсервация спермы может обеспечить больший контроль над размножением между популяциями, которые физически или временно разделены, и может позволить генетическому управлению маточного стада отбирать желаемые признаки, такие как термическая толерантность^{или устойчивость к} болезням. На сегодняшний день биобанкинг коралловой спермы осуществляется в относительно небольших масштабах в^{поддержку управления} биоразнообразием7, поэтому потребуется некоторый уровень масштабирования, если такой биобанкинг хочет реализовать свой потенциал в рамках этих более крупных программ восстановления рифов. Как и в случае со всеми усилиями по восстановлению рифов, основанными на воспроизводстве кораллов, основным препятствием для увеличения усилий по биобанкингу является ограниченный период, в течение которого коралловые гаметы доступны, поскольку нерест у большинства рифообразующих видов совпадает с полнолунием в конце весны и^{начале лета,} а это означает, что гаметы доступны для криоконсервации и биобанкинга только несколько ночей в году. Более того, в регионах, где происходит массовый нерест, например, на Большом Барьерном рифе, как правило, несколько видов нерестятся одновременно или с интервалом в несколько часов в^{одну и ту} же ночь. Таким образом, требуется усовершенствование пути криоконсервации спермы для увеличения масштаба и эффективности обработки для максимального увеличения емкости биобанка в течение этих коротких ежегодных нерестовых окон при одновременном обеспечении целостности образцов и связанных с ними метаданных.

Криоконсервация и биобанкинг спермы кораллов включают в себя несколько ключевых этапов, от сбора гамет во время нереста до поступления образцов в биорепозиторий и базу данных (рис. 1). Процесс начинается с отделения сперматозоидов от яйцеклеток (у гермафродитных видов) или сбора сперматозоидов из толщи воды (у гонохорных видов) с последующей оценкой подвижности и концентрации сперматозоидов. Затем сперматозоиды смешивают с криопротектором (конечная концентрация 10% v/v, диметилсульфоксид, ДМСО) в отфильтрованной морской воде (FSW) и охлаждают до −20 °C/мин в специально разработанном охлаждающем устройстве⁴. Ранние итерации этого процесса основывались на визуальной оценке подвижности и концентрации сперматозоидов с помощью фазово-контрастной микроскопии и подсчета гемоцитометров, печати и маркировки пробирок при обработке образцов для криоконсервации, ручном пипетировании образцов спермы в криовиалы и охлаждении на специально разработанном плавающем штативе¹⁶. Применение компьютерного анализа спермы (CASA)¹⁷ и разработка напечатанного на 3D-принтере охлаждающего^{устройства} повысили эффективность и надежность криоконсервации спермы кораллов, но процесс обработки образцов спермы остался в основном неизменным с момента его создания. Несмотря на то, что этот подход подходит для обработки образцов от умеренного числа колоний и видов в ночь нереста, для больших объемов и количества колоний (например, отдельных образцов от >10 колоний одновременно) существуют узкие места в пути криоконсервации, которые препятствуют своевременной обработке образцов (т.е. в течение 2 ч после высвобождения спермы) без ухудшения потенциала фертильности образца. Несмотря на то, что существуют крупномасштабные системы работы с жидкостями для криовалиальных камер (например, Thomas et ^al.18), они, как правило, предназначены для обработки больших партий (т.е. нескольких штативов криовиалов) и не подходят для транспортировки и использования в полевых условиях, поэтому они не являются экономически эффективными для данного применения. Таким образом, настоящее исследование было направлено на повышение эффективности криоконсервации спермы кораллов путем внедрения портативного, недорогого оборудования и методов автоматизации на ключевых этапах процесса обработки, чтобы максимизировать количество образцов, которые могут быть эффективно криоконсервированы в ночь нереста.

Protocol

Описанные здесь способы могут быть использованы для обработки и криоконсервации спермы как гермафродитных, так и гонохорных видов кораллов. Общее введение и учебник по нересту кораллов и сбору гамет для криоконсервации спермы для обоих репродуктивных режимов можно найти в Смитсоновском национальном зоопарке и Институте биологии охраны кораллов¹⁹. Описанные методы были разработаны в первую очередь с использованием гамет из колоний Acropora millepora , собранных в группе островов Кеппель в море Воппабурра и на рифе Дэвис в море Биндал на Большом Барьерном рифе в Австралии. Весь сбор и использование кораллов и гамет осуществлялись со свободного, предварительного и информированного согласия традиционных хранителей соответствующих стран моря. Реагенты и оборудование, использованные для данного исследования, перечислены в Таблице материалов.

1. Преднерестовая подготовка - проверка системы и приготовление раствора активации сперматозоидов и криодилюента

1. Убедитесь, что сканер штрихкодов заряжен, активен и настроен на ввод данных электронной таблицы в качестве горизонтального ввода в ячейку. Обратитесь к руководству пользователя считывателя штрихкодов, чтобы настроить эту настройку.
2. Приготовьте концентрированные стоковые растворы для активации сперматозоидов кораллов для CASA.
   ПРИМЕЧАНИЕ: При работе с химическими веществами для приготовления раствора активации следует надевать одноразовые перчатки.
   1. Приготовьте 30% исходный раствор бычьего сывороточного альбумина (БСА) (5 мл) путем растворения 1,5 г БСА в 4 мл стерильной очищенной воды для культуры тканей с помощью пробирки, установленной на 37 °С, или держа пробирку в сложенных ладонях, периодически осторожно поворачивая (не встряхивая флакон).
   2. После раствора доведите до конечного объема (5 мл) воду для тканевых культур, нанесите на пробирку дату и отметьте «30% BSA in H₂O».
   3. Хранить в холодильнике (4 °C) до 2 недель.
   4. Приготовьте 60 мМ раствора кофеина (25 мл), растворив 0,2913 г кофеина в 24 мл фильтрованной морской воды (FSW).
   5. После попадания в раствор доведите до конечного объема (25 мл) с помощью FSW, пометьте пробирку датой и отметьте «60 mM кофеин в FSW».
   6. Хранить в холодильнике до 1 месяца.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Максимальная растворимость кофеина в FSW составляет примерно 71 мМ.
3. Приготовьте рабочий раствор для активации сперматозоидов для образцов сперматозоидов в концентрации ~10⁹ сперматозоидов/мл (0,9% БСА + 12 мМ кофеина в FSW).
   1. Для 10 мл рабочего раствора смешайте 2,0 мл 60 мл стокового раствора кофеина + 0,3 мл 30% стокового раствора BSA + 7,7 мл FSW.
   2. На пробирке должна быть указана дата и "рабочий раствор для активации сперматозоидов - 0,9% БСА + 12 мМ кофеина".
   3. Готовьте каждый день использования, храните при комнатной температуре (19-30 °C) и выбрасывайте неиспользованный раствор в конце дня.
4. Готовят криопротекторные растворы (криодилюенты). Убедитесь, что при работе с криопротектором ДМСО надеты одноразовые перчатки.
   ПРИМЕЧАНИЕ: FSW получают с различными концентрациями криопротекторов в зависимости от начальной концентрации сперматозоидов в образце и желаемой конечной концентрации криоконсервированных аликвот в сперматозоидах. При приготовлении криодилюента убедитесь, что FSW аликвотируется в пробирке объемом 50 мл до добавления ДМСО.
   1. Соберите сырую морскую воду из системы резервуаров, в которых содержатся кораллы до нереста (соленость ~35 ppt).
   2. Фильтруйте сырую морскую воду с помощью бутылочной системы фильтрации, прикрепленной к вакуумному насосу с установленным непирогенным мембранным фильтром длиной 0,2 мкм.
   3. Для концентрации сперматозоидов ≥2 × 10–⁹ сперматозоидов/мл приготовьте 20% ДМСО в FSW, соединив 10 мл ДМСО + 40 мл FSW в пробирке объемом 50 мл.
   4. Для концентрации сперматозоидов <2 × 10–⁹ сперматозоидов/мл приготовьте 30% ДМСО в FSW, соединив 15 мл ДМСО + 35 мл FSW в пробирке объемом 50 мл.
   5. Наклейте на пробирку дату и концентрацию ДМСО, т.е. 30% ДМСО или 20% ДМСО.
   6. Готовьте каждый день использования, храните при комнатной температуре (19-30 °C) и выбрасывайте неиспользованный раствор в конце каждого дня.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Смешивание ДМСО и FSW создает экзотермическую реакцию, и криодилюент должен быть приготовлен задолго до использования, чтобы обеспечить охлаждение до комнатной температуры. FSW можно хранить при температуре 4 °C для приготовления криодилюента, чтобы уравновесить это выделение тепла.
5. Подготовьте регистратор данных термопары.
   1. Чтобы измерить приблизительную скорость охлаждения каждого цикла криоконсервации, поместите криовиал, содержащий 10% ДМСО, в FSW с помощью зонда термопары, вставленного через крышку в слот для образцов штатива для криоконсервации рядом с образцами спермы.
   2. Чтобы сделать флакон с термопарой, проткните или расплавьте небольшое отверстие в крышке криовиала со штрих-кодом и вставьте через отверстие термопару К-типа или Т-типа. Опустите наконечник щупа термопары вниз до уровня, чтобы он находился в середине образца при заполнении флакона, удерживая наконечник зонда по центру флакона, чтобы избежать контакта с внутренней стенкой флакона. Закройте крышку и удерживайте щуп термопары на месте с помощью горячего клея.
   3. Надев одноразовые перчатки, заполните криовиальную форму со штрих-кодом объемом 10% ДМСО в FSW, равным объему образца спермы, подлежащего криоконсервации.
   4. Приготовьте свежий 10% ДМСО в FSW и ежедневно наполняйте флаконы с термопарами.

2. Подготовка и оценка спермы

1. Для гермафродитных видов (например, видов Acropora ) соберите пучки гамет с поверхности воды с помощью пипетки для переноса объемом 3 мл и поместите их в маркированную пробирку объемом 50 мл в соотношении 5 мл пучков гамет на 5 мл морской воды (общий объем 10 мл).
2. Для гонохорных видов соберите сперму из близкого ко рту полипа с помощью пипетки для переноса объемом 3 мл и поместите образец в пробирку с маркировкой объемом 50 мл, затем перейдите непосредственно к шагу 2.8.
   ПРИМЕЧАНИЕ: Одноразовые перчатки не являются обязательными для сбора и обработки образцов гамет, но при желании их можно надевать. Руки следует тщательно мыть пресной водой или менять перчатки между каждым образцом гаметы, чтобы избежать перекрестного загрязнения.
3. Для гермафродитных видов взбалтывайте пучки сперматозоидов и яйцеклеток, осторожно вращая образец вручную до тех пор, пока пучки не разорвутся.
   Примечание: Некоторые виды Montipora имеют токсин в яйцах, поэтому им необходимо позволить медленно распадаться с минимальным перемешиванием, чтобы избежать повреждения сперматозоидов.
4. Дайте образцу постоять 2 минуты в штативе для пробирок, чтобы яйцеклетки всплыли на поверхность и сперматозоиды осядли (яйцеклетки сформируют розово-коричневый слой на поверхности, и отдельные яйцеклетки будут видны; см. рисунок 1i).
5. Чтобы отделить сперматозоиды и удалить загрязняющие яйцеклетки, осторожно отсасывайте сперматозоиды со дна пробирки с помощью чистой пипетки для переноса объемом 3 мл.
6. Перенесите образец спермы в сетчатый фильтр для клеток размером 100 мкм, расположенный на новой стерильной центрифужной пробирке объемом 50 мл. Проба должна легко проходить через фильтр. Постукивайте по фильтру, чтобы стимулировать поток пробы, и при необходимости можно использовать чистую трансферную пипетку для сбора остатков проб с нижней стороны фильтра. Снимите фильтр, затем плотно закройте трубку, чтобы обеспечить воздухообмен.
7. Пометьте отфильтрованный образец спермы идентификатором колонии ID и переместите образец на рабочую станцию для оценки спермы.
8. Откройте файл автоматического технического описания биобанка кораллов (Дополнительный файл 1). На вкладке «Оценка сперматозоидов» введите метаданные колонии кораллов (столбцы A-H).
9. Подготовьте сперму для оценки CASA.
   1. Хорошо перемешайте образец спермы и удалите аликвоту объемом 10 мкл в пустую микроцентрифужную пробирку объемом 1,8 мл.
   2. Немедленно добавьте 0,390 мл рабочего раствора для активации сперматозоидов по каплям в течение 10-20 с, аккуратно перемешивая сперму с раствором. Это дает коэффициент разведения 1:39 (сперма: раствор, v/v) (или коэффициент разбавления 40), что обеспечивает подходящую концентрацию для оценки CASA (~50 × 10⁶/мл), если концентрация исходных сперматозоидов составляет ~2 × 10⁹ сперматозоидов/мл. Переверните пробирку 5 раз и задерните крышку пробирки перед открытием, чтобы раствор осел на дне пробирки.
      ПРИМЕЧАНИЕ: Концентрация сперматозоидов для CASA должна быть в диапазоне 8-50 × 10⁶/мл для точного отслеживания сперматозоидов¹⁷. При необходимости в аликвоту исходной спермы можно добавить дополнительный рабочий раствор для активации сперматозоидов для снижения концентрации. Пересчитайте степень разбавления и введите это значение в таблицу. В случаях, когда необходимо одновременно обрабатывать много образцов, в микроцентрифужные пробирки объемом 1,8 мл можно предварительно загрузить 0,390 мл рабочего раствора для активации спермы с добавлением непосредственно в него аликвоты образца спермы объемом 10 мкл, а затем хорошо перемешать, перевернув пробирку на 10× и щелкнув крышкой пробирки перед открытием.
10. Оцените подвижность сперматозоидов и концентрацию активированного образца с помощью компьютерного анализа спермы (CASA), как описано в Zuchowicz et ^al.17 , поместив 4 мкл активированной суспензии сперматозоидов в счетную камеру Маклера²⁰ или путем визуальной оценки и подсчета гемоцитометра с помощью фазово-контрастной микроскопии, как описано в Hagedorn et ^al.4.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Камеру Makler и покровное стекло необходимо тщательно очистить 70% этанолом, затем дистиллированной водой и протереть безворсовой салфеткой между образцами.
11. Введите коэффициент разбавления сперматозоидов, используемый для оценки CASA, и введите выходные данные CASA для концентрации сперматозоидов (миллион/мл), общей подвижности (%) и прогрессирующей подвижности (%) в автодаташитет.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Дополнительные метрики CASA, включая среднюю скорость пути (VAP), прямолинейную скорость (VSL) и криволинейную скорость (VCL), можно дополнительно включить в автоматическую таблицу данных или получить из сохраненных файлов CASA позже.
12. Запишите концентрацию сперматозоидов на отфильтрованной пробирке с образцом спермы и перенесите образец на рабочую станцию криоконсервации в том же порядке, в котором происходит разрыв и обработка пучка.

3. Разбавление сперматозоидов и уравновешивание криопротекторов

1. На рабочей станции криоконсервации откройте тот же файл автоматической таблицы биобанков кораллов, который используется на рабочей станции оценки спермы, и выберите вкладку Криоконсервация . Проверьте этикетку пробирки с образцом спермы и определите соответствующую запись, проверив идентификатор колонии (столбец C). Если вы не обращаетесь к одному и тому же файлу автотаблицы одновременно между рабочими станциями, вручную введите данные в идентификатор колонии (столбец C) и концентрацию сперматозоидов (столбец F) в автоматическом техническом отеле.
2. С помощью серологической пипетки измерьте объем образца спермы, втянув образец в пипетку и вытолкнув его обратно в ту же пробирку; введите значение в колонку Е.
3. Проверьте автоматически рассчитанный столбец I для требуемой концентрации криопротектора и столбец H для объема добавляемого криодилюента (Таблица 1).
4. Запустите таймер на 10 минут и с помощью серологической пипетки немедленно начните добавлять криодилюент по каплям, постоянно осторожно перемешивая образец, обеспечивая при этом надевание одноразовых перчаток для работы с ДМСО.
5. Время добавления криодилюента запишите в колонку Р.

Концентрация сперматозоидов	Криодилюент	Соотношение разведения (сперма:криодилюент)	Конечная концентрация ДМСО в образце спермы (%)
< 2 × 109/мл	30% ДМСО в FSW	2:1	10%
≥ 2 × 109/мл	20% ДМСО в FSW	1:1	10%

Таблица 1: Концентрация криодилюента и коэффициенты разбавления для криоконсервации спермы кораллов, основанные на оценке общей концентрации сперматозоидов в образце, подлежащем криоконсервации.

4. Криоконсервация спермы

1. Прочтите столбец K, чтобы определить, сколько криовиалов нужно заполнить. Он автоматически рассчитывается на основе общего объема спермы и желаемого объема на флакон (в большинстве случаев 1 мл). В течение 10-минутного инкубационного периода выполните шаги с 4.2 по 4.6.
2. Откупорьте стерильные криовиалы со штрих-кодом и установите крышки на чистую/стерильную поверхность.
3. Необязательно: Напишите прогон # на каждом криовиале, используя перманентный маркер; Это может помочь в быстрой идентификации образцов для включения в биобанк.
4. С помощью серологической пипетки и дозатора аликвотирования, настроенного на желаемый объем образца (1 мл), аликвотные образцы разливаются в незакрытые криовики со штрих-кодом и колпачки.
5. Поместите одну пробирку с термопарой и все полные пробирки с образцами на пустую криостойку при комнатной температуре. Убедитесь, что поверхность со штрих-кодом на всех флаконах обращена наружу.
6. При необходимости поместите дополнительные манекены, содержащие 10% ДМСО в FSW, в пустые места на криостойке, чтобы убедиться, что все места заняты.
7. Введите номер прогона в автоматическое техническое описание (столбец U) и отсканируйте серийный номер криостойки (QR-код) в столбец V.
8. Поместите курсор в нужную ячейку столбца Z и выполните сканирование в пробирке с термопарой, а затем все криовиальные пробирки, загруженные на стойку (колонка AA и далее). Не наклоняйте штатив на бок, чтобы проба не попала в резьбу флакона.
9. Во время сканирования проверьте, что данные вводятся в правильную ячейку и что все криовиалы были отсканированы один раз.
10. Отложите загруженные и отсканированные стеллажи на оставшийся период уравновешивания криопротектора и подготовьте охлаждающий сосуд к криоконсервации.
11. Наполните охлаждающую емкость криорешетки жидким азотом до соответствующего заданного уровня, необходимого для охлаждения при температуре приблизительно −20 °C/мин.
    ПРИМЕЧАНИЕ: Азот следует использовать только в хорошо проветриваемых помещениях, так как существует риск удушья. При работе с жидким азотом необходимо надевать обувь с закрытым носком, защитные очки/лицевые щитки и криоперчатки. Обратитесь к институциональным рекомендациям для получения конкретной информации о работе с жидким азотом и его использовании.
12. По истечении 10-минутного периода уравновешивания криопротектора подключите зонд термопары к регистратору данных и начните запись, затем аккуратно поместите полную криостойку в охлаждающий сосуд и накройте крышкой.
13. Запишите время начала в столбец Q.
14. После того, как пробирка с термопарой покажет на регистраторе данных температуру −80 °C или ниже, охладите образцы в жидком азоте, перенеся вставку криостойки в ванну с жидким азотом в отдельном сосуде, таком как полистирольная коробка.
15. Извлеките криовиалы из стеллажа и перенесите их в сухой транспортер для транспортировки в биохранилище.

Discussion

Полуавтоматизированный процесс обработки, описанный в этом протоколе, позволяет эффективно обрабатывать и криоконсервировать сперму кораллов для получения генетики от видов, находящихся под угрозой исчезновения, и поддержки усилий по восстановлению и адаптации рифов. Мотивацией для разработки данного протокола послужило отсутствие существующих систем, отвечающих требованиям к пропускной способности криоконсервации коралловой спермы и использованию криоконсервации, поскольку высокопроизводительные системы обработки для криоконсервации спермы обычно основаны на упаковке образцов во французские соломинки объемом 0,25 мл или 0,5 мл^21,22. Для сравнения, криовиалы обычно используются либо в небольших масштабах для обработки с низкой пропускной способностью (например, криоконсервация лабораторных образцов для исследований^23,24), либо в высокопроизводительных системах обработки объемных образцов с использованием дорогостоящего непортативного оборудования (например, обработка клеточных культур для промышленности^18,25). Мы также исследовали потенциал использования системы автоматического удаления кап для упрощения снятия и замены криовиальных колпачков, но системы были доступны только для отдельных криовиальных колпачков или для целых криовиальных стоек, поэтому они не представляли собой экономически эффективного решения. В настоящее время в мире существует несколько групп, которые используют протокол криоконсервации, разработанный Хагедорном и соавторами^{, для} обеспечения генетического разнообразия кораллов, и важно, чтобы эта работа продолжала распространяться на большее количество рифов по всему миру. Таким образом, основным соображением при разработке настоящего протокола была необходимость использования экономически эффективных и доступных технологий, которые могли бы быть легко внедрены этими другими группами и которые не были бы непомерно дорогостоящими для новых групп, желающих начать криоконсервацию коралловой спермы.

Ключевым компонентом описанного протокола является улучшенная обработка образцов метаданных с помощью связанных электронных таблиц в Microsoft Excel. Ввод данных, как правило, прост, но следует отметить, что редактирование информации в автоматических таблицах должно выполняться только путем удаления и повторного ввода информации, так как быстрые функции (например, Ctrl + C, Ctrl + V) для редактирования данных потенциально могут повлиять на одновременный ввод данных другими пользователями и могут вызвать проблемы со связыванием данных между электронными таблицами. Важным компонентом метаданных является уникальный идентификатор (а именно идентификатор колонии), который связан с донорской колонией и прикрепляется к образцу на всех этапах пути обработки. Важно, чтобы пробирки с образцами были четко помечены идентификатором колонии во время сбора пучка, и чтобы эта информация была точно переписана на любых новых пробирках, в которые образец переносится во время подготовки (например, во время фильтрации для разделения яйцеклеток и сперматозоидов или для добавления криодилюента). Несмотря на то, что протокол обеспечивает автоматическую передачу информации о качестве образца от оператора CASA на рабочую станцию криоконсервации, проблемы могут возникать при плохом покрытии Интернета или Wi-Fi. При возникновении задержек при передаче данных рекомендуется, чтобы обе рабочие станции работали в автономном режиме и поддерживали отдельные автоматические даташиты, которые впоследствии можно согласовать. Ключевой информацией, требуемой оператором криоконсервации, является идентификатор колонии и концентрация образца, поэтому рекомендуется, чтобы оператор CASA записал концентрацию образца в пробирке с образцом в качестве резервной копии, чтобы гарантировать, что эта информация будет под рукой для подготовки к криоконсервации в случае задержки в загрузке или скачивании метаданных между компьютерами.

Выбор сканера штрих-кода и криовиалов со штрих-кодом, используемых для этого протокола, может варьироваться в зависимости от бюджета и доступности продукта; Тем не менее, есть некоторые ключевые элементы, которые следует учитывать при их выборе. Сканер штрих-кодов должен иметь возможность пользовательских настроек, в частности, возможность изменения спецификаций ввода данных и направления ввода данных. В автоматических даташитах, используемых для этого протокола, используется горизонтальный ввод, но в некоторых случаях (например, при вступлении в биобанк или для других лабораторных целей) может потребоваться вертикальный ввод, поэтому важно, чтобы эта функция была настраиваемой. Несмотря на то, что протокол может использоваться как с 1D, так и с 2D штрих-кодами, рекомендуется, чтобы выбранные криографические коды имели человекочитаемый компонент (например, 1D штрих-коды обычно включают уникальный номер), чтобы обеспечить перекрестную проверку ввода образца во время криоконсервации. В дополнение к вводу образцов, сканер штрих-кодов может использоваться для автоматизации ввода некоторых полей метаданных путем создания и распечатки QR-кодов для информации, которая повторяется в образцах (например, названия видов, даты и местоположения рифов) до начала нереста. Затем эту информацию можно быстро и легко ввести в автоматические спецификации путем сканирования с помощью сканера штрих-кодов. Кроме того, прикрепляя штрих-коды с серийными номерами к каждой криостойке и термопарному зонду, можно также связать каждый цикл криоконсервации с определенным набором оборудования в базе данных, что полезно для контроля качества и выявления компонентов, требующих ремонта или замены.

Ограничивающими факторами при обработке часто являются время, затраченное на ожидание распада пучков, и время, необходимое для фильтрации и отделения сперматозоидов от яйцеклеток до CASA и криоконсервации. По возможности рекомендуется обрабатывать образцы в том порядке, в котором пучки распадаются; Тем не менее, дальнейшее повышение эффективности может быть достигнуто за счет стратегического управления заказами на обработку образцов. Например, если на одну колонию приходится 5 или менее криодилюентов из-за малого объема образца (т.е. менее 3 мл сперматозоидов на колонию) или низкой концентрации сперматозоидов, требующей разведения криодилюентом в соотношении 2:1 (т.е. менее 2 × 10⁹/мл), то лучше добавить криодилюент в два образца колонии одновременно, чтобы их можно было запустить вместе на одной криостойке (всего # доступных слотов = 11), вместо того, чтобы запускать их отдельно с манекенами, заполняющими пустые места. Кроме того, можно одновременно запускать несколько криоштативных аппаратов (для образцов объемом >6 мл) при условии, что все процессы могут быть завершены в течение 10-минутного времени уравновешивания криодилюента, что может еще больше увеличить производительность образца. Тем не менее, при использовании нескольких криостендов или объединении нескольких колоний на одном криостенде необходимо позаботиться о том, чтобы метаданные криоконсервации были назначены правильному образцу в автоматической даташите, особенно если образцы крионируются в порядке, отличном от их оценки CASA.

В дополнение к разработке полуавтоматизированного рабочего процесса, настоящее описание протокола также содержит два методологических сравнения, связанных с концентрацией сперматозоидов, которые направлены на улучшение анализа спермы и результатов криоконсервации. Как правило, сбор 5 мл пучков гамет на 5 мл морской воды (общий объем 10 мл) приведет к концентрации сперматозоидов на уровне или выше 2 × 10⁹ клеток/мл, но бывают случаи, когда концентрация сперматозоидов может быть ниже из-за видовых различий или разрыва пучков во время сбора. Использование криодилюента ДМСО в более высокой концентрации (30% v/v) снижает количество разбавленных сперматозоидов, что помогает свести к минимуму колебания концентрации сперматозоидов в криовиальной камере от партии к партии. Важно отметить, что использование 30% ДМСО для достижения конечной концентрации ДМСО не влияет на параметры концентрации или подвижности после оттаивания, как показано репрезентативными данными на рисунке 3. Второе методологическое сравнение представляет собой альтернативу одноразовым предметным стеклам с фиксированным покровным стеклом, обычно используемым в CASA. Основная проблема с использованием коммерчески доступных предметных стекол для анализа спермы кораллов заключается в том, что они могут повлиять на точность оценки подвижности из-за прилипания сперматозоидов к покрытию предметного стекла. Использование решения для активации позволяет решить эту проблему во многих, но не во всех образцах, поэтому по-прежнему рекомендуется выполнять отдельный анализ CASA на подвижность с использованием простого предметного стекла для обеспечения надежности и согласованности. Использование счетной камеры Маклера устраняет необходимость анализа концентрации и подвижности по отдельности и потенциально повышает точность измерений концентрации (рис. 2), поэтому рекомендуется для использования с текущим протоколом. Учитывая это расхождение в измерениях концентрации, о котором^{сообщалось ранее,} важно всегда записывать детали предметного стекла в базу данных вместе с данными о качестве спермы и, по возможности, быть последовательным в выборе типа используемого предметного стекла камеры, чтобы свести к минимуму вариации от партии к партии и обеспечить надежные расчеты соотношения сперматозоидов и яйцеклеток для оплодотворения.

Описанный в настоящем документе полуавтоматический процесс обеспечивает стандартизированный и эффективный путь криоконсервации и биохранения спермы из находящихся под угрозой исчезновения видов кораллов при сохранении биобезопасности и качества образца. Описанный протокол легко переносится и относительно недорог для реализации в программах по всему миру, которые работают над обеспечением существующего разнообразия кораллов с использованием криоконсервации, что будет иметь важное значение для предотвращения вымирания и максимизации ресурсов, доступных для усилий по восстановлению рифов сейчас и в будущем.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ovation ALI-Q 2 VS Pipette Controller - Aliquotting pipette	Vistalab	2100-1005	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
5 mL serological pipettes (bulk)	Thermo Scientific	Nunc 170355	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
10 mL serological pipettes (bulk)	Thermo Scientific	Nunc  170356	Fluid handling – measuring sperm volume, addition of cryoprotectant solution, aliquoting samples into cryovials
P2 0.2–2 µL pipettor	Gilson	F144054M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P10 1–10 µL pipettor	Gilson	F144055M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P20 2–20 µL pipettor	Gilson	F144056M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P200 20–200 µL pipettor	Gilson	F144058M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
P1000 100–1000 µL pipettor	Gilson	F144059M	Preparation of sperm activation solutions and sperm sample handling for concentration and motiliy assessment
Vacuum pump	Millipore	WP6122050	Preparation of filtered sea water for solution preparation
Reusable bottle-top filtration system	Thermo Scientific	DS0320-5045	Preparation of filtered sea water for solution preparation
0.22-µm filter discs, mixed cellulose esters	Merck Millipore	GSWP04700	Preparation of filtered sea water for solution preparation
Filtered sea water	N/A	–	Base medium for sperm activation and cryoprotectant solutions
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D4540	Cryoprotectant chemical used at a final concentration of 10% v/v in filtered seawater for sperm cryopreservation
Caffeine	Sigma-Aldrich	C0750	Used to activate sperm motility
BSA heat shock fraction	Sigma-Aldrich	A9647	Used to minimise sperm adherance to CASA well slides
15-mL tubes - racked	Thermo Scientific	339651	Preparation of sperm activation solution
50-mL tubes racked	Thermo Scientific	339653	For collection of gamete bundles and filtered sperm samples
Transfer pipettes	Thermo Scientific	Samco 202PK	To aid collection of gamete bundles from the water surface
100-µm filter baskets	Fisher Scientific	22363549	To exclude eggs during separation of the sperm sample
Eppendorf racks	Interpath	511029	Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Eppendorf 1.5-mL tube	Eppendorf	30120086	Dilution and activation of sperm for concentration and motiliy assessment
Glass coverslips 18x18 mm	Brand	4700 45	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Plain glass slides, precleaned, 75x25 mm	Corning	2947	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
Haemocytometer	Hausser Scientific	1492	Assessment of sperm concentration and motility using phase microscopy
CASA slides (Leja 20-µm 4 chamber, SC-20-01-04-B)	IMV Technologies	025107	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Makler sperm counting chamber (CASA)	IVFStore	SM-373	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
accu-bead® counting beads	Hamilton-Thorne	710111	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
CASA system + laptop	Hamilton Thorne	Ceros II	Assessment of sperm concentration and motility using Computer Assisted Sperm Analysis (CASA)
Safety Glasses	Generic	–	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Lab coat	Long sleeve, full length	–	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Cryogloves (pair)	Tempshield	Mid-Arm	Personal protective equi[pment for use when handling DMSO and liquid nitrogen
Medium forceps	Generic	–	For removing cryopreserved samples from the cryo racks and manipulating samples in liquid nitrogen
Barcode scanner (2D compatible)	Zebra	DS2278	For reading 1D and 2D barcodes on cryovials for sample management
2.0-mL CryoStorage Vial, external thread, pre-capped, 2D SafeCode (DataMatrix/ECC200), linear and human readable	Eppendorf	30079434	Barcoded cryovials for cryopreservation of sperm samples
Cryovial rack	Simport	T315	Rack to hold cryovials, with locking base to allow for one hand de-capping and capping
Freezing racks	Custom	–	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing rack lid	Custom	–	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Freezing Thermos – 1.5 Litre 18/8 Stainless Steel Double-Wall Vacuum Food Container	Isosteel	VA-9683	Cryopreservation system custom designed for coral sperm, utilising 3D-printed and readily available components. Parts list and assembly instructions are available in Zuchwicz et al., 2021 (doi:10.1016/j.cryobiol.2021.04.005)
Lab timers	Generic	–	For timing of cryoprotectant equilibration prior to cryopreservation
Nitrogen bath 9L	BelArt	M16807-9104	For quenching samples during cryopreservaton and holding samples during sorting and handling
Thermocouple data logger- multichannel	Omega	HH520	Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Thermocouple probe – Type K	Omega	5SC-TT-K-30-36	Temperature monitoring during cryopreservation to determine freezing rate and end point
Cryo pens/coloured permanent pen	Staedtler Lumocolor	318	Optional for marking cryovial lids to assist with sample management
Dry Shipper - charged	Taylor Wharton	CXR100, or CX500	For transfer of cryopreserved samples from field/collection sites to the biorepository for storage