Ottimizzazione della visualizzazione del trasporto assonale del carico endogeno mediante microscopia a fluorescenza in Caenorhabditis elegans vivente

Il trasporto assonale è un prerequisito per trasportare le proteine assonali dal loro sito di sintesi nel corpo cellulare neuronale alla loro destinazione nell'assone. Di conseguenza, la perdita del trasporto assonale compromette la crescita e la funzione neuronale. Lo studio del trasporto assonale migliora quindi la nostra comprensione della biologia delle cellule neuronali. Con i recenti miglioramenti nell'editing del genoma CRISPR Cas9, la marcatura endogena dei carichi assonali è diventata accessibile, consentendo di andare oltre la visualizzazione del trasporto basata sull'espressione ectopica. Tuttavia, la marcatura endogena spesso comporta una bassa intensità del segnale e richiede strategie di ottimizzazione per ottenere dati affidabili. Qui, descriviamo un protocollo per ottimizzare la visualizzazione del trasporto assonale discutendo i parametri di acquisizione e un approccio di sbiancamento per migliorare il segnale del carico marcato endogeno su un fondo citoplasmatico diffuso. Applichiamo il nostro protocollo per ottimizzare la visualizzazione dei precursori delle vescicole sinaptiche (SVP) marcati da RAB-3 marcati con proteina fluorescente verde (GFP) per evidenziare come la regolazione fine dei parametri di acquisizione possa migliorare l'analisi del carico assonale marcato endogenamente in Caenorhabditis elegans (C. elegans).