Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports endogener Fracht durch Fluoreszenzmikroskopie bei lebenden Caenorhabditis elegans

Der axonale Transport ist eine Voraussetzung, um axonale Proteine von ihrem Syntheseort im neuronalen Zellkörper zu ihrem Bestimmungsort im Axon zu transportieren. Folglich beeinträchtigt der Verlust des axonalen Transports das neuronale Wachstum und die Funktion. Die Erforschung des axonalen Transports verbessert daher unser Verständnis der neuronalen Zellbiologie. Mit den jüngsten Verbesserungen in der CRISPR-Cas9-Genomeditierung ist die endogene Markierung axonaler Frachten zugänglich geworden, was es ermöglicht, über die ektopische expressionsbasierte Visualisierung des Transports hinauszugehen. Die endogene Markierung geht jedoch oft auf Kosten einer geringen Signalintensität und erfordert Optimierungsstrategien, um robuste Daten zu erhalten. Hier beschreiben wir ein Protokoll zur Optimierung der Visualisierung des axonalen Transports, indem wir Akquisitionsparameter und einen Bleaching-Ansatz diskutieren, um das Signal endogener markierter Fracht über diffusen zytoplasmatischen Hintergrund zu verbessern. Wir wenden unser Protokoll an, um die Visualisierung von synaptischen Vesikelvorläufern (SVPs) zu optimieren, die mit grün fluoreszierendem Protein (GFP)-markiertem RAB-3 markiert sind, um hervorzuheben, wie die Feinabstimmung von Erfassungsparametern die Analyse endogen markierter axonaler Fracht in Caenorhabditis elegans (C. elegans) verbessern kann.