Otimizando a visualização do transporte axonal de carga endógena por microscopia de fluorescência em Caenorhabditis elegans vivos

Summary

O artigo descreve a otimização dos parâmetros de aquisição da microscopia de fluorescência para visualizar o transporte axonal de cargas marcadas endógenas com resolução de neurônio único em um nematóide vivo.

Abstract

O transporte axonal é um pré-requisito para fornecer proteínas axonais de seu local de síntese no corpo celular neuronal até seu destino no axônio. Consequentemente, a perda do transporte axonal prejudica o crescimento e a função neuronal. Estudar o transporte axonal, portanto, melhora nossa compreensão da biologia celular neuronal. Com as recentes melhorias na edição do genoma CRISPR Cas9, a marcação endógena de cargas axonais tornou-se acessível, permitindo ir além da visualização do transporte baseada em expressão ectópica. No entanto, a marcação endógena geralmente tem o custo de baixa intensidade de sinal e requer estratégias de otimização para obter dados robustos. Aqui, descrevemos um protocolo para otimizar a visualização do transporte axonal, discutindo parâmetros de aquisição e uma abordagem de branqueamento para melhorar o sinal de carga marcada endógena sobre fundo citoplasmático difuso. Aplicamos nosso protocolo para otimizar a visualização de precursores de vesículas sinápticas (SVPs) marcados por RAB-3 marcado com proteína fluorescente verde (GFP) para destacar como o ajuste fino dos parâmetros de aquisição pode melhorar a análise da carga axonal marcada endogenamente em Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

Ao longo da vida, os neurônios dependem do transporte axonal para entregar proteínas, lipídios e outras moléculas do corpo celular ao seu destino final no axônio. Consequentemente, o comprometimento do transporte axonal está associado a uma perda da função neuronal e está frequentemente envolvido na patologia de distúrbios neurodegenerativos ^1,2. Portanto, entender os mecanismos subjacentes ao transporte axonal é de grande interesse.

Várias décadas de pesquisa sobre o transporte axonal revelaram muitos insights importantes sobre a maquinaria molecul....

Protocol

Para um protocolo detalhado sobre como manter e preparar nematóides para imagens de células vivas, consulte o trabalho de S.Niwa ⁷.

1. Geração de cepas de vermes

Além de gerar cepas de nematóides, o Caenorhabditis Genetics Center (CGC)⁸ contém uma coleção crescente de cepas de nematóides com proteínas marcadas com fluorescência endogena que podem ser obtidas .......

Discussion

Limitações do método e métodos alternativos
Neste protocolo, otimizamos os parâmetros de aquisição para visualizar o transporte axonal do RAB-3 marcado endogenamente, que está associado a precursores de vesículas sinápticas. Para visualizar o RAB-3, usamos uma cepa⁶ FLIP-on::GFP::RAB-3 publicada recentemente e expressamos a Flippase recombinase sob um promotor específico de célula (glr-4p)²⁵. Essa estratégia.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)