Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

В работе описана оптимизация параметров сбора данных флуоресцентной микроскопии для визуализации аксонального транспорта эндогенных меченых грузов с однонейронным разрешением у живой нематоды.

Abstract

Аксональный транспорт является необходимым условием для доставки аксональных белков от места их синтеза в теле нейронной клетки к месту их назначения в аксоне. Следовательно, потеря аксонального транспорта нарушает рост и функцию нейронов. Таким образом, изучение аксонального транспорта улучшает наше понимание биологии нейрональных клеток. С недавними улучшениями в редактировании генома CRISPR Cas9 эндогенная маркировка аксональных грузов стала доступной, что позволило выйти за рамки визуализации транспорта на основе эктопической экспрессии. Тем не менее, эндогенная маркировка часто происходит за счет низкой интенсивности сигнала и требует стратегий оптимизации для получения надежных данных. В данной статье мы описываем протокол оптимизации визуализации аксонального транспорта путем обсуждения параметров сбора данных и подхода к отбеливанию для улучшения сигнала эндогенного меченого груза на диффузном цитоплазматическом фоне. Мы применяем наш протокол для оптимизации визуализации предшественников синаптических везикул (SVP), меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP), меченным RAB-3, чтобы показать, как тонкая настройка параметров сбора может улучшить анализ эндогенно меченого аксонального груза у Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

На протяжении всей жизни нейроны полагаются на аксональный транспорт для доставки белков, липидов и других молекул из тела клетки к их конечному пункту назначения в аксоне. Следовательно, нарушение аксонального транспорта связано с потерей функции нейронов и часто участвует в патологии нейродегенеративных расстройств 1,2. Следовательно, понимание механизмов, лежащих в основе аксонального транспорта, представляет большой интерес.

Несколько десятилетий исследований аксонального транспорта позволили получить много важных сведений о молекулярных механиз....

Protocol

Подробный протокол о том, как поддерживать и подготавливать нематод для визуализации живых клеток, см. в работе S.Niwa 7.

1. Генерация штамма червя

В дополнение к генерированию штаммов нематод, Генетический центр Caenorhabditis .......

Representative Results

Обзор модельной системы и методики измерений
Чтобы визуализировать аксональный транспорт предшественников синаптических везикул, мы проследили эндогенно меченый GFP RAB-3. Здесь мы используем недавно сгенерированныйштамм 6 GFP::Flip-on::RAB-3, в котором.......

Discussion

Ограничения метода и альтернативные методы
В этом протоколе мы оптимизировали параметры сбора данных для визуализации аксонального транспорта эндогенно меченого RAB-3, который связан с предшественниками синаптических везикул. Для визуализации RAB-3 мы испол.......

Acknowledgements

Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории Йогева и Хаммарлунда за техническую помощь, отзывы и обсуждения. Мы хотели бы выразить особую благодарность Грейс Суэйм за руководство по визуализации живых клеток, а также Грейс и Брайана Суэйма за первоначальную организацию ручного анализа кимографа в лаборатории. OG поддерживается стипендией Вальтера-Беньямина, финансируемой Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) -Project# 465611822. SY финансируется за счет гранта NIH R35-GM131744.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
AgaroseSigma-AldrichA9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover GlassThomas Scientific6672A14
LevamisoleChemCruzsc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filterNikonSpinning Disc Confocal Microscope
 NIS-elements ARNikonSoftware for the Nikon Ti2 
Plain precleaned microscopy slidesThermo Scientific420-004T
Nematode strainIdentifierSource
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)MTS1161 Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)

References

  1. Millecamps, S., Julien, J. P. Axonal transport deficits and neurodegenerative diseases. Nat Rev Neurosci. 14 (3), 161-176 (2013).
  2. Brady, S. T., Morfini, G. A. Regulation of motor proteins, axonal t....

Explore More Articles

Caenorhabditis elegansCRISPR Cas9RAB 3

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved