Оптимизация визуализации аксонального транспорта эндогенного груза с помощью флуоресцентной микроскопии у живых Caenorhabditis elegans

Summary

В работе описана оптимизация параметров сбора данных флуоресцентной микроскопии для визуализации аксонального транспорта эндогенных меченых грузов с однонейронным разрешением у живой нематоды.

Abstract

Аксональный транспорт является необходимым условием для доставки аксональных белков от места их синтеза в теле нейронной клетки к месту их назначения в аксоне. Следовательно, потеря аксонального транспорта нарушает рост и функцию нейронов. Таким образом, изучение аксонального транспорта улучшает наше понимание биологии нейрональных клеток. С недавними улучшениями в редактировании генома CRISPR Cas9 эндогенная маркировка аксональных грузов стала доступной, что позволило выйти за рамки визуализации транспорта на основе эктопической экспрессии. Тем не менее, эндогенная маркировка часто происходит за счет низкой интенсивности сигнала и требует стратегий оптимизации для получения надежных данных. В данной статье мы описываем протокол оптимизации визуализации аксонального транспорта путем обсуждения параметров сбора данных и подхода к отбеливанию для улучшения сигнала эндогенного меченого груза на диффузном цитоплазматическом фоне. Мы применяем наш протокол для оптимизации визуализации предшественников синаптических везикул (SVP), меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP), меченным RAB-3, чтобы показать, как тонкая настройка параметров сбора может улучшить анализ эндогенно меченого аксонального груза у Caenorhabditis elegans (C. elegans).

Introduction

На протяжении всей жизни нейроны полагаются на аксональный транспорт для доставки белков, липидов и других молекул из тела клетки к их конечному пункту назначения в аксоне. Следовательно, нарушение аксонального транспорта связано с потерей функции нейронов и часто участвует в патологии нейродегенеративных расстройств ^1,2. Следовательно, понимание механизмов, лежащих в основе аксонального транспорта, представляет большой интерес.

Несколько десятилетий исследований аксонального транспорта позволили получить много важных сведений о молекулярных механиз....

Protocol

Подробный протокол о том, как поддерживать и подготавливать нематод для визуализации живых клеток, см. в работе S.Niwa ⁷.

1. Генерация штамма червя

В дополнение к генерированию штаммов нематод, Генетический центр Caenorhabditis .......

Discussion

Ограничения метода и альтернативные методы
В этом протоколе мы оптимизировали параметры сбора данных для визуализации аксонального транспорта эндогенно меченого RAB-3, который связан с предшественниками синаптических везикул. Для визуализации RAB-3 мы испол.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Agarose	Sigma-Aldrich	A9539
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass	Thomas Scientific	6672A14
Levamisole	ChemCruz	sc-205730
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter	Nikon		Spinning Disc Confocal Microscope
NIS-elements AR	Nikon		Software for the Nikon Ti2
Plain precleaned microscopy slides	Thermo Scientific	420-004T
Nematode strain	Identifier	Source
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II)	Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052)	MTS1161	Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/)