A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
В работе описана оптимизация параметров сбора данных флуоресцентной микроскопии для визуализации аксонального транспорта эндогенных меченых грузов с однонейронным разрешением у живой нематоды.
Аксональный транспорт является необходимым условием для доставки аксональных белков от места их синтеза в теле нейронной клетки к месту их назначения в аксоне. Следовательно, потеря аксонального транспорта нарушает рост и функцию нейронов. Таким образом, изучение аксонального транспорта улучшает наше понимание биологии нейрональных клеток. С недавними улучшениями в редактировании генома CRISPR Cas9 эндогенная маркировка аксональных грузов стала доступной, что позволило выйти за рамки визуализации транспорта на основе эктопической экспрессии. Тем не менее, эндогенная маркировка часто происходит за счет низкой интенсивности сигнала и требует стратегий оптимизации для получения надежных данных. В данной статье мы описываем протокол оптимизации визуализации аксонального транспорта путем обсуждения параметров сбора данных и подхода к отбеливанию для улучшения сигнала эндогенного меченого груза на диффузном цитоплазматическом фоне. Мы применяем наш протокол для оптимизации визуализации предшественников синаптических везикул (SVP), меченных зеленым флуоресцентным белком (GFP), меченным RAB-3, чтобы показать, как тонкая настройка параметров сбора может улучшить анализ эндогенно меченого аксонального груза у Caenorhabditis elegans (C. elegans).
На протяжении всей жизни нейроны полагаются на аксональный транспорт для доставки белков, липидов и других молекул из тела клетки к их конечному пункту назначения в аксоне. Следовательно, нарушение аксонального транспорта связано с потерей функции нейронов и часто участвует в патологии нейродегенеративных расстройств 1,2. Следовательно, понимание механизмов, лежащих в основе аксонального транспорта, представляет большой интерес.
Несколько десятилетий исследований аксонального транспорта позволили получить много важных сведений о молекулярных механиз....
Подробный протокол о том, как поддерживать и подготавливать нематод для визуализации живых клеток, см. в работе S.Niwa 7.
1. Генерация штамма червя
В дополнение к генерированию штаммов нематод, Генетический центр Caenorhabditis .......
Обзор модельной системы и методики измерений
Чтобы визуализировать аксональный транспорт предшественников синаптических везикул, мы проследили эндогенно меченый GFP RAB-3. Здесь мы используем недавно сгенерированныйштамм 6 GFP::Flip-on::RAB-3, в котором.......
Ограничения метода и альтернативные методы
В этом протоколе мы оптимизировали параметры сбора данных для визуализации аксонального транспорта эндогенно меченого RAB-3, который связан с предшественниками синаптических везикул. Для визуализации RAB-3 мы испол.......
Авторы заявляют об отсутствии конкурирующих или финансовых интересов, которые могли бы повлиять на работу, представленную в этой статье.
Авторы хотели бы поблагодарить лаборатории Йогева и Хаммарлунда за техническую помощь, отзывы и обсуждения. Мы хотели бы выразить особую благодарность Грейс Суэйм за руководство по визуализации живых клеток, а также Грейс и Брайана Суэйма за первоначальную организацию ручного анализа кимографа в лаборатории. OG поддерживается стипендией Вальтера-Беньямина, финансируемой Deutsche Forschungsgemeinschaft (DFG, German Research Foundation) -Project# 465611822. SY финансируется за счет гранта NIH R35-GM131744.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
Agarose | Sigma-Aldrich | A9539 | |
Cover slips (22 mm x 22 mm, No1); Gold Seal Cover Glass | Thomas Scientific | 6672A14 | |
Levamisole | ChemCruz | sc-205730 | |
Microscope: Nikon Ti2 inverted microscope, Yokogawa CSU-W1 SoRa Scanhead, Hamatsu Orca-Fusion BT sCMOS camera, Nikon CFI Plan Apo lambda 60x 1.4 NA oil immersion objective, Nikon photostimulation scanner at 488nm with an ET525/36 emission filter | Nikon | Spinning Disc Confocal Microscope | |
NIS-elements AR | Nikon | Software for the Nikon Ti2 | |
Plain precleaned microscopy slides | Thermo Scientific | 420-004T | |
Nematode strain | Identifier | Source | |
rab-3(ox699[GFP::flip-on::rab-3]) (II); shyIs43(glr-4p::FLP-NLSx2; odr-1p::RFP) (II) | Park et al. (DOI: 10.1016/j.cub.2023.07.052) | MTS1161 | Will be deposited at CGC (https://cgc.umn.edu/) |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved