Optimera visualisering av axonal transport av endogen last genom fluorescensmikroskopi i levande Caenorhabditis elegans

Axonal transport är en förutsättning för att leverera axonala proteiner från deras syntesplats i den neuronala cellkroppen till deras destination i axonen. Följaktligen försämrar förlust av axonal transport neuronal tillväxt och funktion. Att studera axonal transport förbättrar därför vår förståelse av neuronal cellbiologi. Med de senaste förbättringarna av CRISPR Cas9-genomredigering har endogen märkning av axonala laster blivit tillgänglig, vilket gör det möjligt att gå bortom ektopisk uttrycksbaserad visualisering av transport. Endogen märkning sker dock ofta på bekostnad av låg signalintensitet och kräver optimeringsstrategier för att få robusta data. Här beskriver vi ett protokoll för att optimera visualiseringen av axonal transport genom att diskutera insamlingsparametrar och en blekningsmetod för att förbättra signalen från endogent märkt last över diffus cytoplasmatisk bakgrund. Vi använder vårt protokoll för att optimera visualiseringen av synaptiska vesikelprekursorer (SVP) märkta med grönt fluorescerande protein (GFP)-märkta RAB-3 för att belysa hur finjusterande insamlingsparametrar kan förbättra analysen av endogent märkt axonal last i Caenorhabditis elegans (C. elegans).