Генерация нейронной сетчатки из плюрипотентных стволовых клеток человека

Summary

В настоящем протоколе описывается оптимизированная 3D-система индукции нейронной сетчатки, которая снижает адгезию и слияние органоидов сетчатки с высокой повторяемостью и эффективностью.

Abstract

Ретинопатия является одной из основных причин слепоты во всем мире. Исследование ее патогенеза имеет важное значение для ранней диагностики и своевременного лечения ретинопатии. К сожалению, этические барьеры препятствуют сбору доказательств от людей. Недавние многочисленные исследования показали, что плюрипотентные стволовые клетки человека (ПСК) могут быть дифференцированы в органоиды сетчатки (РО) с использованием различных протоколов индукции, которые имеют огромный потенциал в ретинопатии для моделирования заболеваний, скрининга лекарств и терапии на основе стволовых клеток. В этом исследовании описывается оптимизированный протокол индукции для генерации нейронной сетчатки (NR), который значительно снижает вероятность везикуляции и слияния, увеличивая вероятность успеха продукции до 60-го дня. Основываясь на способности ПСК к самореорганизации после диссоциации, в сочетании с определенными комплементарными факторами, этот новый метод может специфически стимулировать дифференцировку NR. Кроме того, этот подход является несложным, экономически эффективным, демонстрирует значительную повторяемость и эффективность, представляет обнадеживающие перспективы для персонализированных моделей заболеваний сетчатки и обеспечивает обильный резервуар клеток для таких применений, как клеточная терапия, скрининг лекарств и тестирование генной терапии.

Introduction

Глаз служит основным источником информации среди органов чувств человека, а сетчатка является основной зрительной сенсорной тканью в глазах млекопитающих¹. Ретинопатия является одной из основных глобальных причин заболеваний глаз, приводящих к слепоте². Около 2,85 миллиона человек во всем мире страдают от различных степеней нарушения зрения, вызванных ретинопатией³. Следовательно, изучение его патогенеза имеет решающее значение для ранней диагностики и своевременного лечения. Большинство исследований ретинопатии человека были в основном сосредоточены на животных моделях

Protocol

Данное исследование было проведено в соответствии с принципами Хельсинкской декларации и одобрено Комитетом по институциональной этике Китайской больницы общего профиля НОАК. Линейка ESC WA09 (H9) была получена от научно-исследовательского института WiCell.

1. Приготовлени.......

Discussion

Человеческие ОР могут пространственно и во времени повторять развитие сетчатки плода, а ранние ОР демонстрируют высокую степень сходства с сетчаткой плода на эквивалентных стадиях развития¹⁵. С точки зрения морфологии тканей и молекулярной экспрессии, человеческий обрат?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.01 M TPBS	Servicebio	G0002	Washing slices
4% Paraformaldehyde	Servicebio	G1101-500ML	Fix retinal organoids
5 mL Pasteur pipette	NEST Biotechnology	318516	Pipette retinal organoids
96 V-bottomed conical wells	Sumitomo Bakelit	MS-9096VZ
Adhesion Microscope Slides	CITOTEST	188105	Fix slices
AggreWell medium	STEMCELL Technologies	5893	Medium
Anhydrous ethanol	SINOPHARM	10009218	Dehydrate
Anti-CHX10	Santa Cruz	sc-365519	Primary antibody
Antifade Solution	ZSGB-BIO	ZLI-9556
Anti-KI67	Abcam	ab16667	Primary antibody
Anti-NESTIN	Sigma	N5413	Primary antibody
Anti-Neuronal Class III β-Tubulin(TUJ1)	Beyotime	AT809	Primary antibody
Anti-PAX6	Abcam	ab195045	Primary antibody
Cell dissociation solution(CDS)	STEMCELL Technologies	7922	Cell dissociation
CHIR99021	Selleckchem	S2924	GSK-3α/β inhibitor
Cholesterol Lipid Concentrate	Gibco	12531018	250×
Citrate Antigen Retrieval Solution	Servicebio	G1202-250ML	20×, pH 6.0
CS10	STEMCELL Technologies	1001061	Cell Freezing Medium
DAPI	Roche	10236276001	Nuclear counterstain
Dimethyl sulfoxide(DMSO)	Sigma	D2650
DMEM/F12	Gibco	11330032	Medium
DMEM/F12-GlutaMAX	Gibco	10565018	Medium
Donkey anti-Mouse Alexa Fluor Plus 488	Invitrogen	A32766	Secondary Antibody
Donkey anti-Rabbit Alexa Fluor 568	Invitrogen	A10042	Secondary Antibody
Ethylene Diamine Tetraacetic Acid (EDTA)	Biosharp	BL518A	0.5 M, pH 8.0, cell dissociation
Extracellular matrix (ECM)	Corning	354277	Coating plates
F12-Glutamax	Gibco	31765035	Medium
Fetal Bovine Serum	Gibco	A5669701
Flow-like tissue cell quantitative analyzer	TissueGnostics	TissueFAXS Plus	Scan sections
IMDM-GlutaMAX	Gibco	31980030	Medium
IWR1-endo	Selleckchem	S7086	Wnt-inhibitor
KnockOut Serum Replacement	Gibco	10828028
LDN-193189 2HCl	Selleckchem	S7507	BMP-inhibitor
Low-adhesion 24-well Plates	Corning	3473
Low-adhesion 6-well Plates	Corning	3471
Maintenance medium (MM)	STEMCELL Technologies	85850	Medium
N2 supplement	Gibco	17502048
Normal Donkey Serum	Solarbio	SL050	Blocking buffer
Paraplast	Leica	39601006	Tissue embedding
PBS pH 7.4 basic (1x)	Gibco	C10010500BT	Without Ca+,Mg+
Reconbinant human bone morphogenetic protein-4(rhBMP4)	R&D	314-BP	Key protein factor
Retinoic acid	Sigma	R2625	Powder, keep out of light
SB431542	Selleckchem	S1067	ALK5-inhibitor
SU5402	Selleckchem	S7667	Tyrosine kinase inhibitor
Super PAP Pen	ZSGB-BIO	ZLI-9305
Taurine	Sigma	T0625-10G
Thioglycerol	Sigma	M1753
Triton X-100	Sigma	X100	Permeabilization
WA09 embryonic stem cell line	WiCell Research Institute		Cell line
Xylene	SINOPHARM	10023418	Dewaxing
Y-27632 2HCL	Selleckchem	S1049	ROCK-inhibitor