Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

זיהוי וכימות מבוססי תגובת שרשרת פולימראז בזמן אמת (PCR) של DNA של נגיף הפטיטיס B (HBV) היא שיטה רגישה ומדויקת לאבחון וניטור זיהום HBV. כאן, אנו מציגים פרוטוקול לזיהוי DNA HBV ומדידת עומס נגיפי של דגימה.

Abstract

נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא גורם משמעותי למחלות כבד ברחבי העולם. זה יכול להוביל לזיהומים חריפים או כרוניים, מה שהופך אנשים רגישים מאוד שחמת קטלנית וסרטן הכבד. זיהוי וכימות מדויקים של DNA HBV בדם חיוניים לאבחון וניטור זיהום HBV. השיטה הנפוצה ביותר לזיהוי DNA HBV היא PCR בזמן אמת, אשר ניתן להשתמש בו כדי לזהות את הנגיף ולהעריך את העומס הנגיפי כדי לפקח על התגובה לטיפול אנטי ויראלי. כאן, אנו מתארים פרוטוקול מפורט לזיהוי וכימות של DNA HBV בסרום אנושי או פלזמה באמצעות ערכה מבוססת PCR בזמן אמת המסומנת IVD. הערכה משתמשת בפריימרים ובבדיקות המכוונים לאזור הליבה השמור ביותר של גנום HBV ויכולים לכמת במדויק את כל הגנוטיפים של HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I ו-J). הערכה כוללת גם בקרה פנימית אנדוגנית לניטור עיכוב PCR אפשרי. בדיקה זו נמשכת 40 מחזורים, והחיתוך שלה הוא 38 Ct. לכימות DNA HBV בדגימות קליניות, מסופקת ערכה של 5 תקני כימות עם הערכה. התקנים מכילים ריכוזים ידועים של DNA ספציפי ל- HBV המכוילים כנגד התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). התקנים משמשים לאימות הפונקציונליות של הגברה ספציפית ל- HBV DNA וליצירת עקומה סטנדרטית, המאפשרת לכמת DNA HBV בדגימה. DNA HBV נמוך של 2.5IU/mL זוהה באמצעות ערכת PCR. הרגישות הגבוהה ויכולת השחזור של הערכה הופכות אותה לכלי רב עוצמה במעבדות קליניות, ומסייעת לאנשי מקצוע בתחום הבריאות באבחון וניהול יעיל של זיהומי HBV.

Introduction

נגיף הפטיטיס B (HBV) הוא נגיף DNA דו-גדילי חלקית מהסוג Orthohepadnavirus וממשפחת Hepadnaviridae 1. זה יכול לעורר זיהום כרוני שנמשך לאורך כל החיים, מה שעלול להוביל שחמת הכבד קרצינומה hepatocellular 2,3,4. על פי ארגון הבריאות העולמי (WHO), אוכלוסייה מוערכת של 296 מיליון אנשים חיו עם זיהום כרוני הפטיטיס B בשנת 2019, ו -1.5 מיליון אנשים נדבקו חדשים מדי שנה5.

זיהוי ומדידה של DNA HBV בדגימות סרום או פלזמה משמשים כשיטה רבת ערך לאיתור אנשים עם זיהום מתמשך בהפטיטיס B, הערכת יעילות הטיפול האנט....

Protocol

מחקר זה לא כלל משתתפים אנושיים או דגימות קליניות. החומר הביולוגי היחיד ששימש היה התקן הבינלאומיהרביעי של ארגון הבריאות העולמי ל- HBV DNA לבדיקת חומצות גרעין (קוד NIBSC 10/266). תקן זה הוא חומר עזר הזמין לציבור ואינו מכיל מידע אישי או נתונים הניתנים לזיהוי. כיוון שכך, לא נדרש אישור אתי למחקר זה.<.......

Representative Results

דיאגרמה סכמטית של תהליך העבודה לזיהוי וכימות דנ"א HBV מפלזמה/סרום אנושי מוצגת באיור 1. תרשים הגברה של תקן 2 (המשמש כמחשב) ו-NTC עבור HBV ו-IC מוצג באיור 2. איור 3 מראה את עקומות ההגברה עבור דגימה חיובית ל-HBV, דגימה שלילית ל-HBV ודגימה עם עיכוב PCR. עקומת ההג.......

Discussion

קוד NIBSC 10/266 הוקצה ליחידה של 9,55,000 IU/mL כאשר הוא מורכב מחדש ב- 0.5 מ"ל של מים ללא Nuclease בהתאם למידע הספק21. זה יכול להיחשב מדגם חיובי HBV עומס גבוה. העומס הנגיפי של HBV שנקבע על-ידי ערכת העומס הנגיפי ששימשה במחקר זה היה 6,65,900 IU/mL (איור 4). מכיוון שיעילות מיצוי הדנ"א של כל ערכת מי.......

Acknowledgements

אנו מודים לפראבין, קוסום, צ'נדאן, אישה, רשמי, בבלי, שיבני, אנקיטה ושייקה על עזרתם הטכנית.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNANIBSCNIBSC code: 10/266The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines ThermoFisher ScientificABI 7500; QuantStudio 5This is a real time PCR machine 
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198NIBSCNIBSC code: 14/198This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machineQiagenRotor-Gene QThis is a real time PCR machine 
TRUPCR HBV Viral Load kit Kilpest India Limited3B294This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction KitKilpest India Limited3B214This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198

References

  1. Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroentero....

Explore More Articles

JoVE202B HBVPCRCt

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved