Rilevamento e quantificazione in tempo reale del DNA del virus dell'epatite B basato sulla reazione a catena della polimerasi

Summary

Il rilevamento e la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B (HBV) basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale sono un metodo sensibile e accurato per diagnosticare e monitorare l'infezione da HBV. Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento del DNA dell'HBV e la misurazione della carica virale di un campione.

Abstract

Il virus dell'epatite B (HBV) è una causa significativa di malattie del fegato in tutto il mondo. Può portare a infezioni acute o croniche, rendendo gli individui altamente suscettibili alla cirrosi fatale e al cancro al fegato. Il rilevamento e la quantificazione accurati del DNA dell'HBV nel sangue sono essenziali per la diagnosi e il monitoraggio dell'infezione da HBV. Il metodo più comune per rilevare il DNA dell'HBV è la PCR in tempo reale, che può essere utilizzata per rilevare il virus e valutare la carica virale per monitorare la risposta alla terapia antivirale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione e la quantificazione del DNA dell'HBV nel siero o nel plasma umano utilizzando un kit basato su PCR in tempo reale marcato IVD. Il kit utilizza primer e sonde che mirano alla regione centrale altamente conservata del genoma dell'HBV e possono quantificare con precisione tutti i genotipi di HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J). Il kit include anche un controllo interno endogeno per monitorare l'eventuale inibizione della PCR. Questo test viene eseguito per 40 cicli e il suo cutoff è di 38 Ct. Per la quantificazione del DNA dell'HBV nei campioni clinici, con il kit viene fornito un set di 5 standard di quantificazione. Gli standard contengono concentrazioni note di DNA specifico per l'HBV che sono calibrate rispetto al 4^° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per il test dell'acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Gli standard sono utilizzati per convalidare la funzionalità dell'amplificazione del DNA HBV-specifico e per generare una curva standard, consentendo la quantificazione del DNA dell'HBV in un campione. Il DNA dell'HBV fino a 2,5 UI/mL è stato rilevato utilizzando il kit PCR. L'elevata sensibilità e riproducibilità del kit lo rendono un potente strumento nei laboratori clinici, aiutando gli operatori sanitari a diagnosticare e gestire efficacemente le infezioni da HBV.

Introduction

Il virus dell'epatite B (HBV) è un virus a DNA parzialmente a doppio filamento del genere Orthohepadnavirus e della famiglia Hepadnaviridae ¹. Può scatenare un'infezione cronica che persiste per tutta la vita, portando potenzialmente a cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare ^2,3,4. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2019 una popolazione stimata di 296 milioni di persone conviveva con l'infezione cronica da epatite B e 1,5 milioni di persone venivano infettate ogni anno⁵.

Protocol

Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani o campioni clinici. L'unico materiale biologico utilizzato è stato il 4^° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per il test dell'acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Questo standard è un materiale di riferimento disponibile al pubblico che non contiene informazioni personali o dati identificabili. Pertanto, non è stata richiesta alcuna approvazione etica per questo studio.

1. Estrazione del DNA

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Discussion

Al codice NIBSC 10/266 è stata assegnata un'unità di 9,55,000 UI/mL quando ricostituito in 0,5 mL di acqua priva di nucleasi secondo le informazioni del fornitore²¹. Questo può essere considerato un campione positivo all'HBV ad alto carico. La carica virale dell'HBV determinata dal kit di carica virale utilizzato in questo studio è stata di 6.65.900 UI/mL (Figura 4). Poiché l'efficienza di estrazione del DNA di qualsiasi kit di estrazione del DNA non è del 100%,.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNA	NIBSC	NIBSC code: 10/266	The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines	ThermoFisher Scientific	ABI 7500; QuantStudio 5	This is a real time PCR machine
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198	NIBSC	NIBSC code: 14/198	This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machine	Qiagen	Rotor-Gene Q	This is a real time PCR machine
TRUPCR HBV Viral Load kit	Kilpest India Limited	3B294	This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction Kit	Kilpest India Limited	3B214	This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198