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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Il rilevamento e la quantificazione del DNA del virus dell'epatite B (HBV) basati sulla reazione a catena della polimerasi (PCR) in tempo reale sono un metodo sensibile e accurato per diagnosticare e monitorare l'infezione da HBV. Qui presentiamo un protocollo per il rilevamento del DNA dell'HBV e la misurazione della carica virale di un campione.

Abstract

Il virus dell'epatite B (HBV) è una causa significativa di malattie del fegato in tutto il mondo. Può portare a infezioni acute o croniche, rendendo gli individui altamente suscettibili alla cirrosi fatale e al cancro al fegato. Il rilevamento e la quantificazione accurati del DNA dell'HBV nel sangue sono essenziali per la diagnosi e il monitoraggio dell'infezione da HBV. Il metodo più comune per rilevare il DNA dell'HBV è la PCR in tempo reale, che può essere utilizzata per rilevare il virus e valutare la carica virale per monitorare la risposta alla terapia antivirale. Qui, descriviamo un protocollo dettagliato per la rilevazione e la quantificazione del DNA dell'HBV nel siero o nel plasma umano utilizzando un kit basato su PCR in tempo reale marcato IVD. Il kit utilizza primer e sonde che mirano alla regione centrale altamente conservata del genoma dell'HBV e possono quantificare con precisione tutti i genotipi di HBV (A, B, C, D, E, F, G, H, I e J). Il kit include anche un controllo interno endogeno per monitorare l'eventuale inibizione della PCR. Questo test viene eseguito per 40 cicli e il suo cutoff è di 38 Ct. Per la quantificazione del DNA dell'HBV nei campioni clinici, con il kit viene fornito un set di 5 standard di quantificazione. Gli standard contengono concentrazioni note di DNA specifico per l'HBV che sono calibrate rispetto al 4° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per il test dell'acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Gli standard sono utilizzati per convalidare la funzionalità dell'amplificazione del DNA HBV-specifico e per generare una curva standard, consentendo la quantificazione del DNA dell'HBV in un campione. Il DNA dell'HBV fino a 2,5 UI/mL è stato rilevato utilizzando il kit PCR. L'elevata sensibilità e riproducibilità del kit lo rendono un potente strumento nei laboratori clinici, aiutando gli operatori sanitari a diagnosticare e gestire efficacemente le infezioni da HBV.

Introduction

Il virus dell'epatite B (HBV) è un virus a DNA parzialmente a doppio filamento del genere Orthohepadnavirus e della famiglia Hepadnaviridae 1. Può scatenare un'infezione cronica che persiste per tutta la vita, portando potenzialmente a cirrosi epatica e carcinoma epatocellulare 2,3,4. Secondo l'Organizzazione Mondiale della Sanità (OMS), nel 2019 una popolazione stimata di 296 milioni di persone conviveva con l'infezione cronica da epatite B e 1,5 milioni di persone venivano infettate ogni anno5.

Protocol

Questo studio non ha coinvolto partecipanti umani o campioni clinici. L'unico materiale biologico utilizzato è stato il 4° standard internazionale dell'OMS per il DNA dell'HBV per il test dell'acido nucleico (codice NIBSC 10/266). Questo standard è un materiale di riferimento disponibile al pubblico che non contiene informazioni personali o dati identificabili. Pertanto, non è stata richiesta alcuna approvazione etica per questo studio.

1. Estrazione del DNA

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Representative Results

Nella Figura 1 è mostrato un diagramma schematico del flusso di lavoro per rilevare e quantificare il DNA dell'HBV dal plasma/siero umano. Nella Figura 2 è mostrato un grafico di amplificazione dello Standard 2 (utilizzato come PC) e NTC sia per HBV che per IC. La Figura 3 mostra le curve di amplificazione per un campione HBV-positivo, un campione HBV-negativo e un campione con inibizione della PCR. La curva di amplificazione, il .......

Discussion

Al codice NIBSC 10/266 è stata assegnata un'unità di 9,55,000 UI/mL quando ricostituito in 0,5 mL di acqua priva di nucleasi secondo le informazioni del fornitore21. Questo può essere considerato un campione positivo all'HBV ad alto carico. La carica virale dell'HBV determinata dal kit di carica virale utilizzato in questo studio è stata di 6.65.900 UI/mL (Figura 4). Poiché l'efficienza di estrazione del DNA di qualsiasi kit di estrazione del DNA non è del 100%,.......

Acknowledgements

Ringraziamo Praveen, Kusum, Chandan, Isha, Rashmi, Babli, Shivani, Ankita e Shikha per la loro assistenza tecnica.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
4th WHO International Standard for hepatitis B virus DNANIBSCNIBSC code: 10/266The 4th WHO International Standard for hepatitis B virus (HBV) DNA, NIBSC code 10/266, is intended to be used for the calibration of secondary reference reagents used in HBV nucleic acid amplification techniques (NAT).
ABI real-time PCR machines ThermoFisher ScientificABI 7500; QuantStudio 5This is a real time PCR machine 
HBV, HCV and HIV Multiplex 14/198NIBSCNIBSC code: 14/198This is a very low positive triplex reagent for NAT assays containing hepatitis B (HBV), hepatitis C (HCV) and human immunodeficiency virus-1 (HIV-1)
QIAGEN real-time PCR machineQiagenRotor-Gene QThis is a real time PCR machine 
TRUPCR HBV Viral Load kit Kilpest India Limited3B294This is a real time PCR based kit used in this study for the HBV DNA detection and viral load determination
TRUPCR Viral Nucleic Acid Extraction KitKilpest India Limited3B214This is a DNA extraction kit used for the extraction of HBV viral DNA from NIBSC:10/266 and NIBSC:14/198

References

  1. Ryu, W. -. S. . Molecular Virology of Human Pathogenic Viruses. , (2016).
  2. Lin, X., et al. Chronic hepatitis b virus infection in the Asia-Pacific region and Africa: Review of disease progression. Journal of Gastroentero....

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