Interferência de RNA no parasitoide de ovos, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Summary

A manipulação de RNA de interferência (RNAi) apresenta um formidável desafio em muitas espécies de parasitoides com tamanho diminuto, como as vespas Trichogramma . Este estudo delineou um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. A presente metodologia fornece um modelo robusto para investigar a regulação gênica em vespas Trichogramma .

Abstract

Os parasitoides de ovos, Trichogramma spp, são reconhecidos como eficientes agentes de controle biológico contra diversas pragas de lepidópteros na agricultura e florestas. Os estágios imaturos da prole de Trichogramma desenvolvem-se dentro do ovo hospedeiro, exibindo notável diminuividade (aproximadamente 0,5 mm de comprimento adulto). A metodologia de RNA-interferência (RNAi) tem emergido como uma ferramenta crucial para elucidar funções gênicas em inúmeros organismos. No entanto, a manipulação de RNAi em certas espécies de pequenos parasitoides, como Trichogramma, tem geralmente representado desafios significativos. Neste estudo, apresentamos um método RNAi eficiente em Trichogramma denrolimi. O procedimento delineado abrange a aquisição e o isolamento de espécimes individuais de T. dendrolimi a partir de ovos hospedeiros, o planejamento e a síntese de RNA de fita dupla (dsRNA), o transplante e cultivo in vitro de pupas de T. dendrolimi , a microinjeção de dsRNA e a subsequente avaliação do knockdown do gene alvo através da análise de RT-qPCR. Este estudo fornece um procedimento abrangente e visualmente detalhado para a realização de experimentos de RNAi em T. dendrolimi, permitindo que os pesquisadores investiguem a regulação gênica nesta espécie. Além disso, esta metodologia é adaptável para estudos de RNAi ou micro-injeções em outras espécies de Trichogramma com pequenos ajustes, tornando-se uma referência valiosa para a realização de experimentos de RNAi em outras espécies endoparasitárias.

Introduction

Trichogramma spp é um grupo de parasitoides de ovos que tem sido extensivamente utilizado como agentes de controle biológico altamente eficientes contra um amplo espectro de lepidópteros pragas em ecossistemas agrícolas e florestais em todo o mundo 1,2,3,4. A aplicação de Trichogramma criado em massa proporciona uma abordagem ambientalmente correta para o manejo sustentável de pragas ^5,6,7. A compreensão da biologia molecular de ve....

Protocol

NOTA: Consulte a Tabela de Materiais para obter detalhes relacionados a todos os materiais, instrumentos, software e reagentes usados neste protocolo.

1. Coleta e manutenção da cultura de insetos

1. Aderir um grupo de ~5.000 ovos de Corcyra cephalonica (Stainton) em um cartão de 9 cm por 16 cm usando uma solução 1:5 (v/v) de goma arábica em pó e água^25,26.
   NOTA: Evite anexar .......

Discussion

As vespas Trichogramma são reconhecidas como agentes eficazes de controle biológico, visando especificamente uma variedade de pragas de lepidópteros na agricultura e silvicultura¹. Essas vespas diminutas passam por seus estágios imaturos dentro do ovo hospedeiro, característica que apresenta desafios na condução de experimentos com RNAi ^5,18. Este estudo oferece um guia visual abrangente para a realização de experimentos .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911