РНК-интерференция в яйцеклетке паразитоида, Trichogramma dendrolimi Matsumura

Summary

Манипулирование РНК-интерференцией (РНК-интерференцией) представляет собой серьезную проблему для многих паразитоидных видов с миниатюрными размерами, таких как осы Trichogramma . В этом исследовании описан эффективный метод РНК-интерференции у Trichogramma denrolimi. Данная методология представляет собой надежную модель для исследования регуляции генов у ос типа Trichogramma .

Abstract

Паразитоиды яиц, Trichogramma spp, признаны эффективными биологическими средствами борьбы с различными чешуекрылыми вредителями в сельском хозяйстве и лесах. Незрелые стадии потомства Trichogramma развиваются в яйцеклетке хозяина, демонстрируя замечательную миниатюрность (примерно 0,5 мм в длину взрослой особи). Методология РНК-интерференции (РНК-интерференции) стала важнейшим инструментом для выяснения функций генов во многих организмах. Тем не менее, манипулирование РНК-интерференцией у некоторых мелких паразитоидных видов, таких как Trichogramma, в целом представляет значительные проблемы. В данном исследовании мы представляем эффективный метод РНК-интерференции при Trichogramma denrolimi. Описанная процедура включает в себя получение и изоляцию отдельных образцов T. dendrolimi из яйцеклеток хозяина, конструирование и синтез двухцепочечной РНК (дцРНК), трансплантацию in vitro и культивирование куколок T. dendrolimi , микроинъекцию дцРНК и последующую оценку нокдауна гена-мишени с помощью анализа ОТ-кПЦР. Это исследование представляет собой всеобъемлющую, наглядно детализированную процедуру проведения экспериментов с РНК-интерференцией у T. dendrolimi, что позволяет исследователям исследовать регуляцию генов у этого вида. Кроме того, эта методология может быть адаптирована для исследований РНК-интерференции или микроинъекций у других видов трихограмм с незначительными корректировками, что делает ее ценным справочным материалом для проведения экспериментов с РНК-интерференцией у других эндопаразитических видов.

Introduction

Trichogramma spp. представляет собой группу яичных паразитоидов, которые широко используются в качестве высокоэффективных средств биологической борьбы с широким спектром чешуекрылых вредителей в сельскохозяйственных и лесных экосистемах по всему миру 1,2,3,4. Применение трихограммы массового выращивания обеспечивает экологически чистый подход к устойчивой борьбе с вредителями ^5,6,7. Понимание молекулярной биологии ос Trichogram....

Protocol

ПРИМЕЧАНИЕ: См. Таблицу материалов для получения подробной информации, относящейся ко всем материалам, инструментам, программному обеспечению и реагентам, используемым в этом протоколе.

1. Сбор и поддержание культуры насекомых

1. Приклейте группу из.......

Discussion

Осы трихограммы признаны эффективными средствами биологической борьбы, особенно нацеленными на ряд чешуекрылых вредителей в сельском и лесном хозяйстве¹. Эти миниатюрные осы проходят свои незрелые стадии в яйце хозяина, что создает проблемы при проведении экспериме.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
2x ES Taq MasterMix (Dye)	Cowin Biotech, China	CW0690H	To amplify the dsRNA sequences
20x PBS Buffer, DEPC treated (7.2-7.6)	Sangon Biotech, China	B540627-0500	To dilute dsRNA
Agar strip	Shishi Globe Agar Industries Co.,Ltd, China	n/a	To make culture medium
Ampicillin sodium	Sangon Biotech, China	A610028	To make culture medium
Bioer Constant temperature metal bath	BIOER, China	MB-102	To synthesis dsRNA
Borosilicate glass capillary	WPI, USA	1B100-4	To pull capillary glass needle
Clean bench	Airtech, China	SW-CJ-1FD	To extract RNA
Double distilled water	Sangon Biotech, China	A500197-0500	To dilute cDNA
Environmental Testing chamber	Panasonic, Japan	MLR-352H-PC	To culture T. denrolimi
Eppendorf Centrifuge	Eppendrof, Germany	5418R	To store RNA content
Eppendorf FemtoJet 4i	Eppendrof, Germany	FemtoJet 4i	To inject T. denrolimi
Eppendorf Refrigerated Centrifuge	Eppendrof, Germany	5810R	Centrifuge
Ethanol solution (75%, RNase-free)	Aladdin, China	M052131-500ml	To extract RNA
Gel Extraction Kit	Omega, USA	D25000-02	To extract cDNA
GUM Arabic	Solarbio, China	CG5991-500g	To make egg card
Isopropyl alchohol	Aladdin, China	80109218	To extract RNA
Laser-Based Micropipette Puller	SUTTER, USA	P-2000	To pull capillary glass needle
Microloader	Eppendrof, Germany	20 µL	To load dsRNA
Multi-sample tissue grinder	LICHEN, China	LC-TG-24	To grind T. denrolimi
Needle Grinder	SUTTER, USA	BV-10-E	To grind capillary glass needle
Nuclease-Free Water	Sangon Biotech, China		To dilute RNA
OLYMPUS Microscope	OLYMPUS, Japan	XZX16	To observe T. denrolimi
PCR machine	Bio-rad, USA	S-1000	For DNA amplification
PowerPac Basic	Bio-rad, USA	PowerPacTM Basic	To detect the quality of dsRNA
Primer of dsGFP (Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACAAACCAAGGCAAGTAATA
Primer of dsGFP (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG] CAGAGGCATCTTCAACG
Primer of Ferhch for qPCR (Forward)			TGAAGAGATTCTGCGTTCTGCT
Primer of Ferhch for qPCR (Reverse)			CTGTAGGAACATCAGCAGGCTT
Primer of Ferhch for RNAi (Reverse)			[TAATACGACTCACTATAGGG]AG TAGCCATCATCTTTCC
Primer of Ferhch for RNAi(Forward)			[TAATACGACTCACTATAGGG] ACACTGTCAATCGTCCTG
Primer of FoxO for qPCR (Forward)			CTACGCCGATCTCATAACGC
Primer of FoxO for qPCR (Reverse)			TGCTGTCGCCCTTGTCCT
PrimeScript RT reagent Kit with gDNA Eraser (Perfect Real Time)	TaKaRa, Japan	RR047A
Quantitative Real-time PCR	Bio-rad, USA	CFX 96 Touch	To perform reverse transcriptase polymerase chain reaction (RT-PCR)
Real-time PCR (TaqMan) Primer and Probes Design Tool			https://www.genscript.com/tools/real-time-pcr-taqman-primer-design-tool/
T7 RiBoMAX Express RNAi System	Promega, USA	P1700	To synthesis dsRNA  in vitro
TB Green Premix Ex TaqTM (Til RnaseH Plus)	TaKaRa, Japan	RR820A	To perform RT-qPCR
Trichloromethane	KESHI, China	GB/T682-2002	To extract RNA
TRIzol Reagent	Ambion, USA	15596018	To extract total RNA content from samples
Ultra-low Temperature Freezer	Thermo, USA	Forma 911