National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 82101249 til XY Sun), Postdoc Research Foundation of China (bevilling nr. 2022M722125 til XY Sun). Shanghai Sailing Program (bevilling NR. 21YF1425100 til SH Chen). Særligt projekt for klinisk forskning fra Shanghai Municipal Health Commission (bevilling nr. 202340088 til J Zhou). National Natural Science Foundation of China (bevilling nr. 82101262 til X Zhang, bevilling nr. 82101287 til SH Chen).

Alle dyreforsøg blev udført i overensstemmelse med retningslinjerne for dyreforsøgsrapportering i levende forsøg (ARRIVE) og National Institutes of Health Guide for the Care and Use of Laboratory Animals. Denne undersøgelse blev godkendt af Animal Care and Use Committee på Renji Hospital, Shanghai Jiaotong University School of Medicine. Otte uger gamle C57BL/6J hanmus blev brugt til denne undersøgelse. Dyrene blev erhvervet kommercielt (se materialetabellen) og anbragt i standardbure (22 °C ± 2 ...

Optimizing Stereotaxic Microinjection Accuracy in Mice

<ol>
	<li>Liu, D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain-derived+neurotrophic+factor-mediated+projection-specific+regulation+of+depressive-like+and+nociceptive+behaviors+in+the+mesolimbic+reward+circuitry.">Brain-derived neurotrophic factor-mediated projection-specific regulation of depressive-like and nociceptive behaviors in the mesolimbic reward circuitry.</a> Pain. 159 (1), 175 (2018).</li><li>Gan, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Layer-specific+pain+relief+pathways+originating+from+primary+motor+cortex.">Layer-specific pain relief pathways originating from primary motor cortex.</a> Science. 378 (6626), 1336-1343 (2022).</li><li>Laing, B. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Anterior+hypothalamic+parvalbumin+neurons+are+glutamatergic+and+promote+escape+behavior.">Anterior hypothalamic parvalbumin neurons are glutamatergic and promote escape behavior.</a> Curr Biol. 33 (15), 3215-3228 (2023).</li><li>Perens, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Multimodal+3D+mouse+brain+atlas+framework+with+the+skull-derived+coordinate+system.">Multimodal 3D mouse brain atlas framework with the skull-derived coordinate system.</a> Neuroinformatics. 21 (2), 269-286 (2023).</li><li>Adhikari, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Basomedial+amygdala+mediates+top-down+control+of+anxiety+and+fear.">Basomedial amygdala mediates top-down control of anxiety and fear.</a> Nature. 527 (7577), 179-185 (2015).</li><li>Tao, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Projections+from+infralimbic+cortex+to+paraventricular+thalamus+mediate+fear+extinction+retrieval.">Projections from infralimbic cortex to paraventricular thalamus mediate fear extinction retrieval.</a> Neurosci Bull. 37 (2), 229-241 (2021).</li><li>Haggerty, D. L., Grecco, G. G., Reeves, K. C., Atwood, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Adeno-associated+viral+vectors+in+neuroscience+research.">Adeno-associated viral vectors in neuroscience research.</a> Mol Ther Methods Clin Dev. 17, 69-82 (2020).</li><li>Ansarifar, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+volume+and+expression+time+in+an+aav-delivered+channelrhodopsin.">Impact of volume and expression time in an aav-delivered channelrhodopsin.</a> Mol Brain. 16 (1), 77 (2023).</li><li>Gonzalez, T. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structure-guided+AAV+capsid+evolution+strategies+for+enhanced+CNS+gene+delivery.">Structure-guided AAV capsid evolution strategies for enhanced CNS gene delivery.</a> Nat Protoc. 18 (11), 3413-3459 (2023).</li><li>Sun, X. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+parallel+medial+prefrontal+cortex-amygdala+pathways+mediate+memory+deficits+via+glutamatergic+projection+in+surgery+mice.">Two parallel medial prefrontal cortex-amygdala pathways mediate memory deficits via glutamatergic projection in surgery mice.</a> Cell Rep. 42 (7), 112719 (2023).</li><li>Koren, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insular+cortex+neurons+encode+and+retrieve+specific+immune+responses.">Insular cortex neurons encode and retrieve specific immune responses.</a> Cell. 184 (25), 6211 (2021).</li><li>Poller, W. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Brain+motor+and+fear+circuits+regulate+leukocytes+during+acute+stress.">Brain motor and fear circuits regulate leukocytes during acute stress.</a> Nature. 607 (7919), 578-584 (2022).</li><li>Huang, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+habenula+underlies+the+antidepressive+effects+of+light+therapy.">A visual circuit related to habenula underlies the antidepressive effects of light therapy.</a> Neuron. 102 (1), 128-142 (2019).</li><li>Hu, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+visual+circuit+related+to+the+periaqueductal+gray+area+for+the+antinociceptive+effects+of+bright+light+treatment.">A visual circuit related to the periaqueductal gray area for the antinociceptive effects of bright light treatment.</a> Neuron. 110 (10), 1712-1727 (2022).</li><li>Du, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Directed+stepwise+tracing+of+polysynaptic+neuronal+circuits+with+replication-deficient+pseudorabies+virus.">Directed stepwise tracing of polysynaptic neuronal circuits with replication-deficient pseudorabies virus.</a> Cell Rep Methods. 3 (6), 100506 (2023).</li><li>Paxinos, G., Franklin, K. B. J., Franklin, K. B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> The mouse brain in stereotaxic coordinates. 2nd ed. , (2001).</li></ol>

Denne artikel har beskrevet en stabil strategi til at verificere nøjagtigheden af stereotaksiske hjerneinjektioner 5,6 hurtigere og mere simpelt før viral sporing, men det uerstattelige aspekt af reportergenekspression i hjerneregionen er afgørende for mærkning af hjerneregionen. Det blå farvestof, vi brugte, gjorde det muligt at visualisere injektionsstedet med det samme.
Flere kritiske trin i denne protokol bidrager til at forbe...

Næsten alle moderne neuromodulationsværktøjer, herunder in vivo calciumoptagelse, optogenetiske og kemogenetiske værktøjer, kræver brug af stereotaksiske koordinater for at målrette hjernens interesseområde 1,2,3, hvilket danner grundlaget for neural manipulation. Stereotaksiske koordinater for musehjerneområder er defineret i forhold til bregma og lambda, de benede landemærker på kraniet, der danner det såkaldte kranie-afledte stereotaksiske koordinatsystem. Enten bregma eller lambda kan tjene som nulpunktet for de tredimensionelle koordinater. De tre akser er anteroposterior (AP), mediolateral (ML) og dorsoventral (DV), der repræsenterer y-, x- og z-akserne på det digitale display af stereotaksiske instrumenter. For velkendte hjerneområder kan de stereotaksiske koordinatparametre for et specifikt område fås fra musehjerneatlas4 (f.eks. Paxinos og Franklins musehjerne i stereotaksiske koordinater) og/eller den offentliggjorte litteratur 5,6. Yderligere validering er dog nødvendig på grund af variationer i stereotaksisk udstyr og alder/populationer af mus, der bruges af forskellige forskere.
Struktur er grundlaget for funktion. Neurale kredsløb danner grundlaget for mange hjernefunktioner, såsom kognitive aktiviteter, følelser, hukommelse, sensoriske og motoriske funktioner1. Mærkning af strukturen og manipulation af neurale kredsløbs aktivitet er afgørende for at forstå funktionen af et specifikt neuralt kredsløb. I løbet af de sidste årtier har neurale sporstoffer udviklet sig gennem mange generationer; tidlig forskning anvendte hvedekimagglutinin (WGA) og phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) som anterograde sporstoffer og fluorguld (FG), koleratoksin underenhed B (CTB), carbocyanin som retrograde sporstoffer. Men i modsætning til virale sporstoffer kan disse traditionelle neurale sporstoffer ikke integrere eksogene gener i værten, og de har heller ikke celletypeselektivitet. I dag er den virale strategi blevet et vigtigt forslag under grundlæggende neurovidenskabelig forskning. Til forskellige forskningsformål kan forskellige virale værktøjer vælges 7,8. Der er ikke-transsynaptiske vira, trans-multisynaptiske vira (retrograd og anterograd) og trans-monosynaptiske vira (retrograd og anterograd). Hver kategori indeholder flere typer med respektive egenskaber.
Processen med viral administration og ekspression er meget tids- og ressourcekrævende og tager ofte uger eller endnu længere. Blandt forskellige virale vektorer er adeno-associeret virus blevet identificeret som et lovende middel til genlevering, hvilket giver et bredt vindue fra 3 til 8 uger efter injektion for den eksperimentelle procedure 7,8. Efterhånden som AAV udvikler sig, kan analyse udføres 2-3 uger efter administration 9,10. Andre neurale kredsløbssporere, såsom pseudorabiesvirus (PRV) og rabiesvirus (RV), kræver også en sporingsperiode på mindst 2-7 dage 11,12,13,14,15. En foreløbig verifikation af injektionsstedet, før fluorescenssignaler observeres, er således både tids- og omkostningseffektiv.
For at lette en enkel og hurtig verifikation af stereotaksiske injektioner administreres i denne undersøgelse et farvestof før virale vektorer, og kryosektionering gør det muligt for forskere at observere injektionsstedet og spore det inden for 30 minutter efter injektion.

<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td>1.0 &#181;L, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3</td>
			<td>Hamilton</td>
			<td>65458-01</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>200 &#956;L pipette tips</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-200-T</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>20 mL syringe</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>3%H2O2 solution</td>
			<td>Lircon Company</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>6-well plate</td>
			<td>Shengyou Biotech</td>
			<td>20006</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anerdian</td>
			<td>Likang High-tech</td>
			<td>31001002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Anti roll plate</td>
			<td>Leica</td>
			<td>14047742497</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>BD insulin syringe</td>
			<td>Becton,Dickinson and Company</td>
			<td>328421</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Bend toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cellsens dimension software</td>
			<td>Olympus</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cotton swab</td>
			<td>Fisher Scientific</td>
			<td>23-400-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Dapi-Fluoromount-G</td>
			<td>Southernbiotech</td>
			<td>0100-20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Drill</td>
			<td>Longxiang</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine brushes</td>
			<td>HWAHONG</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fine scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>y00030</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Fluorescent microscopy</td>
			<td>Olympus</td>
			<td>BX63</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>freezing microtome</td>
			<td>Leica</td>
			<td>CM1950</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Hemostatic forceps straight with tooth</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J31010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Infusion needle 0.7 mm</td>
			<td>Kindly group</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Lidocaine hydrochloride injection</td>
			<td>Harvest Pharmaceutical Company</td>
			<td>71230803</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Magnifying glass</td>
			<td>M&#38;G Chenguang Stationery</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Male C57/BL mice</td>
			<td>The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research&#8211;BK Laboratory</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Mice coronal brain slice mold</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68713</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge tube</td>
			<td>biosharp</td>
			<td>BS-02-P</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microtome blades</td>
			<td>Leica</td>
			<td>819</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Ophthalmic ointment</td>
			<td>Cisen Pharmaceutical Company</td>
			<td>G23HDM9M4S5</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paraformaldehyde</td>
			<td>Biosharp</td>
			<td>BL539A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Peristaltic pumps</td>
			<td>Harvard Apparatus</td>
			<td>70-4507</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Phosphate buffered saline</td>
			<td>Servicebio</td>
			<td>G4202</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Piette 2-200 &#956;L</td>
			<td>thermofisher</td>
			<td>4642080</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue</td>
			<td>Beyotime</td>
			<td>P0015A</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Shaving blades</td>
			<td>BFYING</td>
			<td>91560618</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Slides</td>
			<td>Citotest Scientific</td>
			<td>188105</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Stereotaxic apparatus</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68807</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Straight toothed dissecting forceps</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>JD1060</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Syringe Holder</td>
			<td>RWD Life Science</td>
			<td>68206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue scissors</td>
			<td>Jinzhong</td>
			<td>J21040</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue-Tek O.C.T compound</td>
			<td>Sakura</td>
			<td>4583</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tribromoethanol</td>
			<td>Aibei Biotechnology</td>
			<td>M2910</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

preliminary validation of stereotaxic injection coordinates via cryosectioning

Stereotaksisk injektion af en specifik hjerneregion udgør en grundlæggende eksperimentel teknik inden for grundlæggende neurovidenskab. Forskere baserer almindeligvis deres valg af stereotaksiske injektionsparametre på musehjerneatlas eller offentliggjort materiale, der anvendte forskellige populationer/aldre af mus og forskelligt stereotaksisk udstyr, hvilket nødvendiggør yderligere validering af de stereotaksiske koordinatparametre. Effektiviteten af calciumbilleddannelse, kemogenetiske og optogenetiske manipulationer er afhængig af den præcise ekspression af reportergener inden for det interesseområde, der ofte kræver flere ugers indsats. Det er således en tidskrævende opgave, hvis koordinaterne for målhjerneregionen ikke verificeres på forhånd. Ved at bruge et passende farvestof i stedet for en virus og implementere kryosektion kan forskere observere injektionsstedet umiddelbart efter farvestofadministration. Dette letter rettidige justeringer af koordinatparametre i tilfælde, hvor der er uoverensstemmelser mellem det faktiske injektionssted og den teoretiske position. Sådanne justeringer forbedrer nøjagtigheden af viral ekspression inden for målområdet betydeligt i efterfølgende eksperimenter.

Nearly all modern neuromodulation tools, including in vivo calcium recording, optogenetic, and chemogenetic tools, require the use of stereotaxic coordinates to target the brain area of interest1,2,3, forming the foundation of neural manipulation. Stereotaxic coordinates for mouse brain regions are defined in relation to bregma and lambda, the bony landmarks on the cranium, forming the so-called skull-derived stereotaxic coordinate system. Either bregma or lambda can serve as the zero point of the three-dimensional coordinates. The three axes are anteroposterior (AP), mediolateral (ML), and dorsoventral (DV), representing the y, x, and z axes on the digital display of stereotaxic instruments. For well-known brain regions, the stereotaxic coordinate parameters of a specific area can be obtained from mouse brain atlases4 (e.g., Paxinos and Franklin&#39;s mouse brain in stereotaxic coordinates) and/or the published literature5,6. However, further validation is necessary due to variations in stereotaxic equipment and the age/populations of mice used by different researchers.
Structure is the basis of function. Neural circuits form the foundation for many brain functions, such as cognitive activities, emotion, memory, sensory, and motor functions1. Labeling the structure and manipulating the activity of neural circuits are vital for understanding the function of a specific neural circuit. Over the past decades, neural tracers have evolved through many generations; early research adopted wheat germ agglutinin (WGA) and phaseolus vulgaris agglutinin (PHA) as anterograde tracers, and fluorogold (FG), cholera toxin subunit B (CTB), carbocyanine as retrograde tracers. However, unlike viral tracers, these traditional neural tracers cannot integrate exogenous genes into the host, nor do they have cell type selectivity. Nowadays, the viral strategy has become an important proposition during basic neuroscience research. For different research purposes, various viral tools can be selected7,8. There are non-transsynaptic viruses, trans-multisynaptic viruses (retrograde and anterograde), and trans-monosynaptic viruses (retrograde and anterograde). Each category contains several types with respective characteristics.
The process of viral administration and expression is highly time- and resource-intensive, often taking weeks or even longer. Among various viral vectors, adeno-associated virus has been identified as a promising means for gene delivery, providing a wide window ranging from 3 to 8 weeks post-injection for the experimental procedure7,8. As AAV evolves, analysis can be performed 2-3 weeks after administration9,10. Other neural circuit tracers, such as pseudorabies virus (PRV) and rabies virus (RV), also require a tracing period of at least 2-7 days11,12,13,14,15. Thus, a preliminary verification of the injection site before observing fluorescence signals is both time- and cost-effective.
To facilitate a simple and rapid verification of stereotaxic injections, in this study, a dye is administered before viral vectors, and cryosectioning enables researchers to observe the injection site and track it within 30 min post-injection.

Author Spotlight: Accelerating Cognitive Impairment Research in Mice Through Stereotaxic Injection and Cost-Effective Dyes

Foreløbig validering af stereotaksiske injektionskoordinater via kryosektion

Denne undersøgelse identificerede injektionsstedet med succes inden for 30 minutter ved hjælp af den demonstrerede metode. I første omgang blev en SDS-PAGE-prøvebelastningsopløsning indeholdende bromphenolblåt injiceret i LDTgV i C57/BL-musene. Figur 1A viser en skematisk fremstilling af injektionen af farvestofopløsningen. Fordelingen af det blå farvestof i LDTgV er illustreret i figur 1B.
Bromphenolblåt blev også injiceret...

Denne protokol beskriver en praktisk strategi til at fremskynde verifikationstrinnet for stereotaksiske injektionskoordinater, før der udføres viral sporing ved hjælp af farvestoffer og frosne sektioner.

Stereotaxic injection of a specific brain region constitutes a fundamental experimental technique in basic neuroscience. Researchers commonly base their ...

Vores forskning fokuserer primært på at undersøge den neurale kredsløbsmekanisme, der ligger til grund for kognitiv svækkelse hos mus. Og vi anvender ofte stereotaksiske teknikker i hjernen i disse undersøgelser. Vores mål er at optimere og fremskynde verifikationsprocessen for stereotaksiske injektionssteder ved hjælp af farvestoffer, hvilket sikrer, at det bliver en enkel og hurtig procedure.Forskellige strategier er blevet afgørende i neurovidenskabelig forskning gennem stereotaksisk injektion af virus. Dette efterfølges af observation af fluorescerende markører i vævsskiver for at bekræfte injektionsstederne, en proces, der tager flere uger at fuldføre. Vores protokol giver fordele i forhold til andre teknikker ved at spare mindst tre dages dehydreringstid og bruge et omkostningseffektivt farvestof til hurtigere identifikation af injektionssteder.Det kan spare uger sammenlignet med ingen foreløbig kontrol.