Validação preliminar de coordenadas de injeção estereotáxica via crioseccionamento

Summary

O presente protocolo descreve uma estratégia prática para agilizar a etapa de verificação das coordenadas de injeção estereotáxica antes de realizar o rastreamento viral usando corantes e seções congeladas.

Abstract

A injeção estereotáxica de uma região específica do cérebro constitui uma técnica experimental fundamental na neurociência básica. Os pesquisadores geralmente baseiam sua escolha de parâmetros de injeção estereotáxica em atlas cerebrais de camundongos ou materiais publicados que empregaram várias populações/idades de camundongos e diferentes equipamentos estereotáxicos, necessitando de validação adicional dos parâmetros de coordenadas estereotáxicas. A eficácia das manipulações de imagens de cálcio, quimiogenéticas e optogenéticas depende da expressão precisa de genes repórteres dentro da região de interesse, muitas vezes exigindo várias semanas de esforço. Assim, é uma tarefa demorada se as coordenadas da região alvo do cérebro não forem verificadas com antecedência. Usando um corante apropriado em vez de um vírus e implementando a criossecção, os pesquisadores podem observar o local da injeção imediatamente após a administração do corante. Isso facilita ajustes oportunos para coordenar os parâmetros nos casos em que existem discrepâncias entre o local real da injeção e a posição teórica. Tais ajustes aumentam significativamente a precisão da expressão viral dentro da região-alvo em experimentos subsequentes.

Introduction

Quase todas as ferramentas modernas de neuromodulação, incluindo registro de cálcio in vivo, ferramentas optogenéticas e quimiogenéticas, requerem o uso de coordenadas estereotáxicas para atingir a área de interesse do cérebro ^1,2,3, formando a base da manipulação neural. As coordenadas estereotáxicas para as regiões do cérebro de camundongos são definidas em relação ao bregma e lambda, os marcos ósseos no crânio, formando o chamado sistema de coordenadas estereotáxicas derivado do crânio. Bregma ou lambda podem servir como o ponto zero das coordenadas tridimensionai....

Protocol

Todos os experimentos com animais foram conduzidos em conformidade com as diretrizes do Animal Research Reporting In Vivo Experiments (ARRIVE) e o Guia do National Institutes of Health para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório. O presente estudo foi aprovado pelo Comitê de Cuidados e Uso de Animais do Hospital Renji, Escola de Medicina da Universidade Jiaotong de Xangai. Camundongos machos C57BL/6J com oito semanas de idade foram usados para o presente estudo. Os animais foram obtidos comercialmente (ver T.......

Discussion

Este artigo descreveu uma estratégia estável para verificar a precisão das injeções cerebrais estereotáxicas ^5,6 mais rápida e simplesmente antes do rastreamento viral, mas o aspecto insubstituível da expressão do gene repórter na região do cérebro é crucial para a rotulagem da região cerebral. O corante azul que usamos permitiu a visualização imediata do local da injeção.

Várias etapas críticas neste protocolo cont.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
1.0 µL, Neuros Syringe, Model 7001 KH, 32 G, Point Style 3	Hamilton	65458-01
200 μL pipette tips	biosharp	BS-200-T
20 mL syringe	Kindly group
3%H2O2 solution	Lircon Company
6-well plate	Shengyou Biotech	20006
Anerdian	Likang High-tech	31001002
Anti roll plate	Leica	14047742497
BD insulin syringe	Becton,Dickinson and Company	328421
Bend toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1050
Cellsens dimension software	Olympus
Cotton swab	Fisher Scientific	23-400-122
Dapi-Fluoromount-G	Southernbiotech	0100-20
Drill	Longxiang
Fine brushes	HWAHONG
Fine scissors	Jinzhong	y00030
Fluorescent microscopy	Olympus	BX63
freezing microtome	Leica	CM1950
Hemostatic forceps straight with tooth	Jinzhong	J31010
Infusion needle 0.7 mm	Kindly group
Lidocaine hydrochloride injection	Harvest Pharmaceutical Company	71230803
Magnifying glass	M&G Chenguang Stationery
Male C57/BL mice	The Shanghai Institute of Planned Parenthood Research–BK Laboratory
Mice coronal brain slice mold	RWD Life Science	68713
Microcentrifuge tube	biosharp	BS-02-P
Microtome blades	Leica	819
Ophthalmic ointment	Cisen Pharmaceutical Company	G23HDM9M4S5
paraformaldehyde	Biosharp	BL539A
Peristaltic pumps	Harvard Apparatus	70-4507
Phosphate buffered saline	Servicebio	G4202
Piette 2-200 μL	thermofisher	4642080
SDS-PAGE sample loading containing bromophenol blue	Beyotime	P0015A
Shaving blades	BFYING	91560618
Slides	Citotest Scientific	188105
Stereotaxic apparatus	RWD Life Science	68807
Straight toothed dissecting forceps	Jinzhong	JD1060
Syringe Holder	RWD Life Science	68206
Tissue scissors	Jinzhong	J21040
Tissue-Tek O.C.T compound	Sakura	4583
Tribromoethanol	Aibei Biotechnology	M2910