Test di aspirazione con micropipetta a fluorescenza per studiare il meccanorilevamento dei globuli rossi

Summary

L'esplorazione del comportamento cellulare sotto stress meccanico è fondamentale per i progressi della meccanica cellulare e della meccanobiologia. Introduciamo la tecnica di aspirazione a fluorescenza con micropipette (fMPA), un nuovo metodo che combina la stimolazione meccanica controllata con l'analisi completa della segnalazione intracellulare nelle singole cellule. Questa tecnica indaga nuovi studi approfonditi sulla meccanobiologia delle cellule vive.

Abstract

I saggi di aspirazione con micropipette sono stati a lungo una pietra miliare per lo studio della meccanica delle cellule vive, offrendo approfondimenti sulle risposte cellulari allo stress meccanico. Questo documento descrive in dettaglio un adattamento innovativo del test di aspirazione con micropipette accoppiate a fluorescenza (fMPA). Il saggio fMPA introduce la capacità di somministrare forze meccaniche precise monitorando contemporaneamente i processi di meccanotrasduzione delle cellule vive mediati dai canali ionici. La sofisticata configurazione incorpora una micropipetta in vetro borosilicato di precisione collegata a un serbatoio d'acqua finemente regolato e a un sistema di aspirazione pneumatica, facilitando l'applicazione a pressione controllata con incrementi fino ± 1 mmHg. Un miglioramento significativo è l'integrazione dell'imaging a epifluorescenza, che consente l'osservazione e la quantificazione simultanee dei cambiamenti morfologici cellulari e dei flussi intracellulari di calcio durante l'aspirazione. Il test fMPA, attraverso la sua combinazione sinergica di imaging a epifluorescenza con aspirazione di micropipette, stabilisce un nuovo standard per lo studio del meccanorilevamento cellulare in ambienti meccanicamente difficili. Questo approccio poliedrico è adattabile a varie configurazioni sperimentali, fornendo informazioni critiche sui meccanismi di meccanorilevamento a singola cellula.

Introduction

Le scoperte in corso nel mondo dei comportamenti cellulari hanno accentuato il ruolo degli stimoli meccanici, come la tensione, lo sforzo di taglio dei fluidi, la compressione e la rigidità del substrato, nel dettare le attività cellulari dinamiche come l'adesione, la migrazione e la differenziazione. Questi aspetti meccanobiologici sono di fondamentale importanza per chiarire come le cellule interagiscono e rispondono al loro ambiente fisiologico, influenzando vari processi biologici ^1,2.

Nell'ultimo decennio, i saggi di aspirazione basati su micropipette si sono distinti come uno ....

Protocol

Questo protocollo segue le linee guida ed è stato approvato dal Comitato Etico per la Ricerca Umana dell'Università di Sydney. Il consenso informato è stato ottenuto dai donatori per questo studio.

1. Isolamento dei globuli rossi umani

NOTA: La fase 1.1 deve essere eseguita da un flebotomo addestrato utilizzando un protocollo approvato dall'Institutional Review Board.

1. Prelevare 5 ml di sangue dalla vena cubitale mediana utilizzando un a.......

Discussion

I saggi di aspirazione con micropipette incarnano una metodologia raffinata, che impiega una sostanziale modulazione della pressione, un'esatta orchestrazione spaziale e un discernimento temporale affidabile per sondare le profonde complessità della biomeccanica cellulare. Questo studio pone particolare enfasi sull'applicazione della fMPA come strumento cruciale per svelare le risposte meccanosensibili sfumate mostrate dai globuli rossi sotto stimoli variabili. L'uso simultaneo di segnali in campo chiaro e fluorescenza .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
µManager	Micro-Manager		Version 2.0.0
1 mL Syringe	Terumo	210320D	Cooperate with the Microfil
200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055	Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips	Knittel Glass	MS0014	Cell chamber assembly
50 mL Syringe	Terumo	220617E	Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000280	Red clood cell preparation
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami	Diligent
Fluorescence light source	CoolLED	pE-300	Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary	Narishige	G-1	Micropipette manufacture
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera	Manta	G-040B	Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
Imaris	Oxford Instruments
Inverted Microscopy	Olympus	Olympus IX83	Micropipette aspiration hardware system
Microfil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip
Micropipette Puller	Sutter instrument	P1000	Micropipette manufacture
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge	Narishige	MF-900	Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump	Scientific Instrument	PV-PUMP	Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit	Sensapex	uM-RM3	Control panel for micropipette position adjustment
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter	Merck Millipore	PHCC340KIT	Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit	Sensapex	uM-TSC	Control panel for micropipette position adjustment
X dry Objective	Olympus	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL	Micropipette aspiration hardware system