Ensaio de Aspiração por Micropipeta de Fluorescência para Investigar Mecanosensing de Hemácias

Summary

A exploração do comportamento celular sob estresse mecânico é fundamental para avanços na mecânica celular e mecanobiologia. Apresentamos a técnica de Fluorescence Micropipeette Aspiration (fMPA), um novo método que combina estimulação mecânica controlada com análise abrangente da sinalização intracelular em células únicas. Esta técnica investiga novos estudos aprofundados da mecanobiologia de células vivas.

Abstract

Os ensaios de aspiração por micropipetas têm sido uma pedra angular para a investigação da mecânica de células vivas, oferecendo informações sobre as respostas celulares ao estresse mecânico. Este trabalho detalha uma adaptação inovadora do ensaio de aspiração por micropipeta acoplada à fluorescência (fMPA). O ensaio de fMPA introduz a capacidade de administrar forças mecânicas precisas enquanto monitora simultaneamente os processos de mecanotransdução de células vivas mediados por canais iônicos. A configuração sofisticada incorpora uma micropipeta de vidro borossilicato projetada com precisão conectada a um reservatório de água finamente regulado e sistema de aspiração pneumática, facilitando a aplicação de pressão controlada com incrementos tão refinados quanto ± 1 mmHg. Um aumento significativo é a integração da imagem de epifluorescência, permitindo a observação e quantificação simultâneas das alterações morfológicas celulares e dos fluxos intracelulares de cálcio durante a aspiração. O ensaio de fMPA, através de sua combinação sinérgica de imagens de epifluorescência com aspiração por micropipeta, estabelece um novo padrão para o estudo da mecanosensing celular em ambientes mecanicamente desafiadores. Esta abordagem multifacetada é adaptável a vários arranjos experimentais, fornecendo insights críticos sobre os mecanismos de mecanosensing de célula única.

Introduction

Os desdobramentos das descobertas no mundo dos comportamentos celulares têm acentuado o papel de estímulos mecânicos, como tensão, tensão de cisalhamento de fluidos, compressão e rigidez do substrato, em ditar atividades celulares dinâmicas, como adesão, migração e diferenciação. Esses aspectos mecanobiológicos são de suma importância na elucidação de como as células interagem e respondem a seus ambientes fisiológicos, impactando diversos processos biológicos ^1,2.

Na última década, ensaios de aspiração baseados em micropipetas têm se destacado como uma ferramenta versátil no estudo ....

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Sydney. Consentimento informado foi obtido dos doadores para este estudo.

1. Isolamento de hemácias humanas

OBS: A etapa 1.1 deve ser realizada por flebotomista treinado, utilizando protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição.

1. Retirar 5 ml de sangue da veia cubital mediana utilizando uma agul.......

Discussion

Os ensaios de aspiração de micropipetas incorporam uma metodologia refinada, empregando modulação de pressão substancial, orquestração espacial exata e discernimento temporal confiável para sondar os meandros profundos da biomecânica celular. Este estudo coloca ênfase particular na aplicação de fMPA como uma ferramenta crucial para desvendar as respostas mecanossensíveis nuançadas apresentadas por eritrócitos sob estímulos variados. O uso concomitante de sinais de campo claro e fluorescência possibilitou.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
µManager	Micro-Manager		Version 2.0.0
1 mL Syringe	Terumo	210320D	Cooperate with the Microfil
200 µL Pipette	Eppendorf	3123000055	Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover Slips	Knittel Glass	MS0014	Cell chamber assembly
50 mL Syringe	Terumo	220617E	Connect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)	Sigma-Aldrich	C1016	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425	Eppendorf	5405000280	Red clood cell preparation
Clexane	Sigma-Aldrich	1235820	To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQami	Diligent
Fluorescence light source	CoolLED	pE-300	Micropipette aspiration hardware system
Glass capillary	Narishige	G-1	Micropipette manufacture
Glucose	Sigma-Aldrich	G8270	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Hepes	Thermo Fisher	15630080	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE camera	Manta	G-040B	Micropipette aspiration hardware system
High speed pressure clamp	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage	Scientific Instrument	HSPC-2-SB	Cooperate with the pressure pump
Imaris	Oxford Instruments
Inverted Microscopy	Olympus	Olympus IX83	Micropipette aspiration hardware system
Microfil	World Precision Instruments	MF34G-5	34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip
Micropipette Puller	Sutter instrument	P1000	Micropipette manufacture
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System	Merck Millipore	ZEQ7000T0C	Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge	Narishige	MF-900	Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)	Sigma-Aldrich	P9541	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump	Scientific Instrument	PV-PUMP	Induce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera	Photometrics	Prime 95B sCMOS	Flourscent imaging
Rotary wheel remote unit	Sensapex	uM-RM3	Control panel for micropipette position adjustment
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter	Merck Millipore	PHCC340KIT	Automatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)	Sigma-Aldrich	S5761	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)	Sigma-Aldrich	S2127	Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)	Sigma-Aldrich	S7653	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)	Sigma-Aldrich	S9638	Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit	Sensapex	uM-TSC	Control panel for micropipette position adjustment
X dry Objective	Olympus	Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL	Micropipette aspiration hardware system