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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

A exploração do comportamento celular sob estresse mecânico é fundamental para avanços na mecânica celular e mecanobiologia. Apresentamos a técnica de Fluorescence Micropipeette Aspiration (fMPA), um novo método que combina estimulação mecânica controlada com análise abrangente da sinalização intracelular em células únicas. Esta técnica investiga novos estudos aprofundados da mecanobiologia de células vivas.

Abstract

Os ensaios de aspiração por micropipetas têm sido uma pedra angular para a investigação da mecânica de células vivas, oferecendo informações sobre as respostas celulares ao estresse mecânico. Este trabalho detalha uma adaptação inovadora do ensaio de aspiração por micropipeta acoplada à fluorescência (fMPA). O ensaio de fMPA introduz a capacidade de administrar forças mecânicas precisas enquanto monitora simultaneamente os processos de mecanotransdução de células vivas mediados por canais iônicos. A configuração sofisticada incorpora uma micropipeta de vidro borossilicato projetada com precisão conectada a um reservatório de água finamente regulado e sistema de aspiração pneumática, facilitando a aplicação de pressão controlada com incrementos tão refinados quanto ± 1 mmHg. Um aumento significativo é a integração da imagem de epifluorescência, permitindo a observação e quantificação simultâneas das alterações morfológicas celulares e dos fluxos intracelulares de cálcio durante a aspiração. O ensaio de fMPA, através de sua combinação sinérgica de imagens de epifluorescência com aspiração por micropipeta, estabelece um novo padrão para o estudo da mecanosensing celular em ambientes mecanicamente desafiadores. Esta abordagem multifacetada é adaptável a vários arranjos experimentais, fornecendo insights críticos sobre os mecanismos de mecanosensing de célula única.

Introduction

Os desdobramentos das descobertas no mundo dos comportamentos celulares têm acentuado o papel de estímulos mecânicos, como tensão, tensão de cisalhamento de fluidos, compressão e rigidez do substrato, em ditar atividades celulares dinâmicas, como adesão, migração e diferenciação. Esses aspectos mecanobiológicos são de suma importância na elucidação de como as células interagem e respondem a seus ambientes fisiológicos, impactando diversos processos biológicos 1,2.

Na última década, ensaios de aspiração baseados em micropipetas têm se destacado como uma ferramenta versátil no estudo ....

Protocol

Este protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Sydney. Consentimento informado foi obtido dos doadores para este estudo.

1. Isolamento de hemácias humanas

OBS: A etapa 1.1 deve ser realizada por flebotomista treinado, utilizando protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição.

  1. Retirar 5 ml de sangue da veia cubital mediana utilizando uma agul.......

Representative Results

Para estabelecer ensaios de aspiração por micropipeta, construímos primeiramente uma câmara celular personalizada composta por dois quadrados metálicos (cobre/alumínio) conectados por uma alça. Duas lamínulas de vidro de terceiro corte (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) foram afixadas para criar uma câmara preenchida com 200 μL de hemácias suspensas no tampão de Tyrode. Depois de introduzir hemácias na câmara, uma micropipeta de borossilicato sob medida foi fixada em um suporte e cuidadosamente posicionada dentro d.......

Discussion

Os ensaios de aspiração de micropipetas incorporam uma metodologia refinada, empregando modulação de pressão substancial, orquestração espacial exata e discernimento temporal confiável para sondar os meandros profundos da biomecânica celular. Este estudo coloca ênfase particular na aplicação de fMPA como uma ferramenta crucial para desvendar as respostas mecanossensíveis nuançadas apresentadas por eritrócitos sob estímulos variados. O uso concomitante de sinais de campo claro e fluorescência possibilitou.......

Acknowledgements

Agradecemos a Nurul Aisha Zainal Abidin e Laura Moldovan pelo recrutamento adicional de doadores, coleta de sangue e apoio à flebotomia. Agradecemos a Tomas Anderson e Arian Nasser pela organização dos equipamentos e reagentes. Esta pesquisa foi financiada pelo Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); o National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); Concessão de Equipamentos NHMRC-L.A.J.; NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Bolsa de Pesquisador em Início de Carreira-L.A.J.); NSW CVRN-VCCRI Bolsa de Inovação em Pesquisa; Escritório de Engajamento Global e de Pesquisa (Sydne....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
µManagerMicro-ManagerVersion 2.0.0
1 mL Syringe Terumo210320DCooperate with the Microfil 
200 µL Pipette Eppendorf 3123000055Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover SlipsKnittel Glass MS0014Cell chamber assembly
50 mL Syringe Terumo220617EConnect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425Eppendorf 5405000280Red clood cell preparation
ClexaneSigma-Aldrich1235820To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQamiDiligent
Fluorescence light sourceCoolLEDpE-300Micropipette aspiration hardware system
Glass capillaryNarishigeG-1Micropipette manufacture
GlucoseSigma-AldrichG8270Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
HepesThermo Fisher15630080Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE cameraMantaG-040BMicropipette aspiration hardware system
High speed pressure clampScientific InstrumentHSPC-2-SBCooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage Scientific InstrumentHSPC-2-SBCooperate with the pressure pump
ImarisOxford Instruments
Inverted Microscopy Olympus Olympus IX83Micropipette aspiration hardware system
Microfil World Precision Instruments MF34G-534 G (67 mm Long)
Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip 
Micropipette Puller Sutter instrumentP1000Micropipette manufacture 
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification SystemMerck MilliporeZEQ7000T0CCarbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge NarishigeMF-900Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump Scientific InstrumentPV-PUMPInduce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera PhotometricsPrime 95B sCMOSFlourscent imaging
Rotary wheel remote unit Sensapex uM-RM3Control panel for micropipette position adjustment 
Scepter 3.0 Handheld Cell CounterMerck MilliporePHCC340KITAutomatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic
Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)
Sigma-AldrichS9638Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit Sensapex uM-TSCControl panel for micropipette position adjustment 
X dry Objective Olympus Olympus 60x/0.70 LUCPlanFLMicropipette aspiration hardware system

References

  1. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
  2. Mierke, C. T. .

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