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A exploração do comportamento celular sob estresse mecânico é fundamental para avanços na mecânica celular e mecanobiologia. Apresentamos a técnica de Fluorescence Micropipeette Aspiration (fMPA), um novo método que combina estimulação mecânica controlada com análise abrangente da sinalização intracelular em células únicas. Esta técnica investiga novos estudos aprofundados da mecanobiologia de células vivas.
Os ensaios de aspiração por micropipetas têm sido uma pedra angular para a investigação da mecânica de células vivas, oferecendo informações sobre as respostas celulares ao estresse mecânico. Este trabalho detalha uma adaptação inovadora do ensaio de aspiração por micropipeta acoplada à fluorescência (fMPA). O ensaio de fMPA introduz a capacidade de administrar forças mecânicas precisas enquanto monitora simultaneamente os processos de mecanotransdução de células vivas mediados por canais iônicos. A configuração sofisticada incorpora uma micropipeta de vidro borossilicato projetada com precisão conectada a um reservatório de água finamente regulado e sistema de aspiração pneumática, facilitando a aplicação de pressão controlada com incrementos tão refinados quanto ± 1 mmHg. Um aumento significativo é a integração da imagem de epifluorescência, permitindo a observação e quantificação simultâneas das alterações morfológicas celulares e dos fluxos intracelulares de cálcio durante a aspiração. O ensaio de fMPA, através de sua combinação sinérgica de imagens de epifluorescência com aspiração por micropipeta, estabelece um novo padrão para o estudo da mecanosensing celular em ambientes mecanicamente desafiadores. Esta abordagem multifacetada é adaptável a vários arranjos experimentais, fornecendo insights críticos sobre os mecanismos de mecanosensing de célula única.
Os desdobramentos das descobertas no mundo dos comportamentos celulares têm acentuado o papel de estímulos mecânicos, como tensão, tensão de cisalhamento de fluidos, compressão e rigidez do substrato, em ditar atividades celulares dinâmicas, como adesão, migração e diferenciação. Esses aspectos mecanobiológicos são de suma importância na elucidação de como as células interagem e respondem a seus ambientes fisiológicos, impactando diversos processos biológicos 1,2.
Na última década, ensaios de aspiração baseados em micropipetas têm se destacado como uma ferramenta versátil no estudo ....
Este protocolo segue as diretrizes e foi aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa com Seres Humanos da Universidade de Sydney. Consentimento informado foi obtido dos doadores para este estudo.
1. Isolamento de hemácias humanas
OBS: A etapa 1.1 deve ser realizada por flebotomista treinado, utilizando protocolo aprovado pelo Comitê de Ética em Pesquisa da instituição.
Para estabelecer ensaios de aspiração por micropipeta, construímos primeiramente uma câmara celular personalizada composta por dois quadrados metálicos (cobre/alumínio) conectados por uma alça. Duas lamínulas de vidro de terceiro corte (40 mm × 7 mm × 0,17 mm) foram afixadas para criar uma câmara preenchida com 200 μL de hemácias suspensas no tampão de Tyrode. Depois de introduzir hemácias na câmara, uma micropipeta de borossilicato sob medida foi fixada em um suporte e cuidadosamente posicionada dentro d.......
Os ensaios de aspiração de micropipetas incorporam uma metodologia refinada, empregando modulação de pressão substancial, orquestração espacial exata e discernimento temporal confiável para sondar os meandros profundos da biomecânica celular. Este estudo coloca ênfase particular na aplicação de fMPA como uma ferramenta crucial para desvendar as respostas mecanossensíveis nuançadas apresentadas por eritrócitos sob estímulos variados. O uso concomitante de sinais de campo claro e fluorescência possibilitou.......
Os autores declaram não ter interesses conflitantes a relatar em relação ao presente estudo.
Agradecemos a Nurul Aisha Zainal Abidin e Laura Moldovan pelo recrutamento adicional de doadores, coleta de sangue e apoio à flebotomia. Agradecemos a Tomas Anderson e Arian Nasser pela organização dos equipamentos e reagentes. Esta pesquisa foi financiada pelo Australian Research Council (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. A.J.); o National Health and Medical Research Council (NHMRC) da Austrália Ideas Grant (APP2003904-L. A.J.); Concessão de Equipamentos NHMRC-L.A.J.; NSW Cardiovascular Capacity Building Program (Bolsa de Pesquisador em Início de Carreira-L.A.J.); NSW CVRN-VCCRI Bolsa de Inovação em Pesquisa; Escritório de Engajamento Global e de Pesquisa (Sydne....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
DAQami | Diligent | ||
Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
Imaris | Oxford Instruments | ||
Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |
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