Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Изучение поведения клеток при механическом напряжении имеет решающее значение для достижений в клеточной механике и механобиологии. Мы представляем метод флуоресцентной микропипеточной аспирации (fMPA), новый метод, сочетающий контролируемую механическую стимуляцию с комплексным анализом внутриклеточной сигнализации в отдельных клетках. Этот метод исследует новые углубленные исследования механобиологии живых клеток.

Abstract

Аспирационные анализы с помощью микропипеток уже давно являются краеугольным камнем для исследования механики живых клеток, давая представление о клеточных реакциях на механический стресс. В данной статье подробно описывается инновационная адаптация метода аспирации микропипеток с флуоресцентной связью (fMPA). Анализ fMPA дает возможность управлять точными механическими силами при одновременном мониторинге процессов механотрансдукции живых клеток, опосредованных ионными каналами. Сложная установка включает в себя прецизионную микропипетку из боросиликатного стекла, подключенную к точно регулируемому резервуару для воды и пневматической системе аспирации, что облегчает применение контролируемого давления с шагом ± 1 мм рт. ст. Существенным усовершенствованием является интеграция эпифлуоресцентной визуализации, позволяющая одновременно наблюдать и количественно оценивать морфологические изменения клеток и внутриклеточные потоки кальция во время аспирации. Анализ fMPA, благодаря синергетическому сочетанию эпифлуоресцентной визуализации с аспирацией микропипеток, устанавливает новый стандарт для изучения клеточного механочувствия в механически сложных средах. Этот многогранный подход может быть адаптирован к различным экспериментальным установкам, обеспечивая критически важное представление о механизмах механочувствительности отдельных клеток.

Introduction

Открытия в мире клеточного поведения подчеркнули роль механических стимулов, таких как растяжение, напряжение сдвига жидкости, сжатие и жесткость субстрата, в определении динамических клеточных активностей, таких как адгезия, миграция и дифференциация. Эти механобиологические аспекты имеют первостепенное значение для выяснения того, как клетки взаимодействуют с физиологической средой и реагируют на нее, влияя на различные биологические процессы 1,2.

За последнее десятилетие аспирационные анализы на основе микропипеток стали универсальным инструментом в изучении различных клеточных р....

Protocol

Этот протокол соответствует руководящим принципам и был одобрен Комитетом по этике исследований на людях Сиднейского университета. Для проведения данного исследования было получено информированное согласие доноров.

1. Изоляция эритроцитов человека

Representative Results

Для проведения аспирационных анализов с помощью микропипеток мы сначала построили специальную камеру, состоящую из двух металлических квадратов (медь/алюминий), соединенных ручкой. Два стеклянных покровных стекла (40 мм × 7 мм × 0,17 мм) были прикреплены для создания камеры, заполненной 200 .......

Discussion

Аспирационные анализы с помощью микропипеток воплощают в себе усовершенствованную методологию, использующую существенную модуляцию давления, точную пространственную оркестровку и надежное временное различение для исследования глубоких тонкостей клеточной биомеханики. В этом иссл.......

Acknowledgements

Мы благодарим Нурул Айшу Зайнал Абидин и Лауру Молдован за дополнительный набор доноров, сбор крови и поддержку флеботомии. Мы благодарим Томаса Андерсона и Ариана Насера за организацию оборудования и реагентов. Это исследование финансировалось Австралийским исследовательским советом (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. А.Дж.); Грант Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (APP2003904-L. А.Дж.); NHMRC Equipment Grant-L.A.J.; Программа наращивания потенциала в области сердечно-сосудистых заболеваний штата Новый Южный Уэльс (Грант для исследователей в начале и середине карьеры, Лос-Анджелес); Грант на исследовательские ин....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
µManagerMicro-ManagerVersion 2.0.0
1 mL Syringe Terumo210320DCooperate with the Microfil 
200 µL Pipette Eppendorf 3123000055Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover SlipsKnittel Glass MS0014Cell chamber assembly
50 mL Syringe Terumo220617EConnect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425Eppendorf 5405000280Red clood cell preparation
ClexaneSigma-Aldrich1235820To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQamiDiligent
Fluorescence light sourceCoolLEDpE-300Micropipette aspiration hardware system
Glass capillaryNarishigeG-1Micropipette manufacture
GlucoseSigma-AldrichG8270Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
HepesThermo Fisher15630080Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE cameraMantaG-040BMicropipette aspiration hardware system
High speed pressure clampScientific InstrumentHSPC-2-SBCooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage Scientific InstrumentHSPC-2-SBCooperate with the pressure pump
ImarisOxford Instruments
Inverted Microscopy Olympus Olympus IX83Micropipette aspiration hardware system
Microfil World Precision Instruments MF34G-534 G (67 mm Long)
Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip 
Micropipette Puller Sutter instrumentP1000Micropipette manufacture 
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification SystemMerck MilliporeZEQ7000T0CCarbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge NarishigeMF-900Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump Scientific InstrumentPV-PUMPInduce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera PhotometricsPrime 95B sCMOSFlourscent imaging
Rotary wheel remote unit Sensapex uM-RM3Control panel for micropipette position adjustment 
Scepter 3.0 Handheld Cell CounterMerck MilliporePHCC340KITAutomatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic
Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)
Sigma-AldrichS9638Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit Sensapex uM-TSCControl panel for micropipette position adjustment 
X dry Objective Olympus Olympus 60x/0.70 LUCPlanFLMicropipette aspiration hardware system

References

  1. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
  2. Mierke, C. T. .

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved