Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Изучение поведения клеток при механическом напряжении имеет решающее значение для достижений в клеточной механике и механобиологии. Мы представляем метод флуоресцентной микропипеточной аспирации (fMPA), новый метод, сочетающий контролируемую механическую стимуляцию с комплексным анализом внутриклеточной сигнализации в отдельных клетках. Этот метод исследует новые углубленные исследования механобиологии живых клеток.

Abstract

Аспирационные анализы с помощью микропипеток уже давно являются краеугольным камнем для исследования механики живых клеток, давая представление о клеточных реакциях на механический стресс. В данной статье подробно описывается инновационная адаптация метода аспирации микропипеток с флуоресцентной связью (fMPA). Анализ fMPA дает возможность управлять точными механическими силами при одновременном мониторинге процессов механотрансдукции живых клеток, опосредованных ионными каналами. Сложная установка включает в себя прецизионную микропипетку из боросиликатного стекла, подключенную к точно регулируемому резервуару для воды и пневматической системе аспирации, что облегчает применение контролируемого давления с шагом ± 1 мм рт. ст. Существенным усовершенствованием является интеграция эпифлуоресцентной визуализации, позволяющая одновременно наблюдать и количественно оценивать морфологические изменения клеток и внутриклеточные потоки кальция во время аспирации. Анализ fMPA, благодаря синергетическому сочетанию эпифлуоресцентной визуализации с аспирацией микропипеток, устанавливает новый стандарт для изучения клеточного механочувствия в механически сложных средах. Этот многогранный подход может быть адаптирован к различным экспериментальным установкам, обеспечивая критически важное представление о механизмах механочувствительности отдельных клеток.

Introduction

Открытия в мире клеточного поведения подчеркнули роль механических стимулов, таких как растяжение, напряжение сдвига жидкости, сжатие и жесткость субстрата, в определении динамических клеточных активностей, таких как адгезия, миграция и дифференциация. Эти механобиологические аспекты имеют первостепенное значение для выяснения того, как клетки взаимодействуют с физиологической средой и реагируют на нее, влияя на различные биологические процессы 1,2.

За последнее десятилетие аспирационные анализы на основе микропипеток стали универсальным инструментом в изучении различных клеточных р....

Protocol

Этот протокол соответствует руководящим принципам и был одобрен Комитетом по этике исследований на людях Сиднейского университета. Для проведения данного исследования было получено информированное согласие доноров.

1. Изоляция эритроцитов человека

Representative Results

Для проведения аспирационных анализов с помощью микропипеток мы сначала построили специальную камеру, состоящую из двух металлических квадратов (медь/алюминий), соединенных ручкой. Два стеклянных покровных стекла (40 мм × 7 мм × 0,17 мм) были прикреплены для создания камеры, заполненной 200 .......

Discussion

Аспирационные анализы с помощью микропипеток воплощают в себе усовершенствованную методологию, использующую существенную модуляцию давления, точную пространственную оркестровку и надежное временное различение для исследования глубоких тонкостей клеточной биомеханики. В этом иссл.......

Disclosures

Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов, которые они могли бы сообщить в отношении настоящего исследования.

Acknowledgements

Мы благодарим Нурул Айшу Зайнал Абидин и Лауру Молдован за дополнительный набор доноров, сбор крови и поддержку флеботомии. Мы благодарим Томаса Андерсона и Ариана Насера за организацию оборудования и реагентов. Это исследование финансировалось Австралийским исследовательским советом (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. А.Дж.); Грант Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (APP2003904-L. А.Дж.); NHMRC Equipment Grant-L.A.J.; Программа наращивания потенциала в области сердечно-сосудистых заболеваний штата Новый Южный Уэльс (Грант для исследователей в начале и середине карьеры, Лос-Анджелес); Грант на исследовательские ин....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
µManagerMicro-ManagerVersion 2.0.0
1 mL Syringe Terumo210320DCooperate with the Microfil 
200 µL Pipette Eppendorf 3123000055Red clood cell preparation
22 x 40 mm Cover SlipsKnittel Glass MS0014Cell chamber assembly
50 mL Syringe Terumo220617EConnect to the water tower
Calcium Chloride (CaCl2)Sigma-AldrichC1016Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Centrifuge 5425Eppendorf 5405000280Red clood cell preparation
ClexaneSigma-Aldrich1235820To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL
DAQamiDiligent
Fluorescence light sourceCoolLEDpE-300Micropipette aspiration hardware system
Glass capillaryNarishigeG-1Micropipette manufacture
GlucoseSigma-AldrichG8270Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
HepesThermo Fisher15630080Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
High speed GigE cameraMantaG-040BMicropipette aspiration hardware system
High speed pressure clampScientific InstrumentHSPC-2-SBCooperate with the pressure pump
High speed pressure clamp head stage Scientific InstrumentHSPC-2-SBCooperate with the pressure pump
ImarisOxford Instruments
Inverted Microscopy Olympus Olympus IX83Micropipette aspiration hardware system
Microfil World Precision Instruments MF34G-534 G (67 mm Long)
Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip 
Micropipette Puller Sutter instrumentP1000Micropipette manufacture 
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification SystemMerck MilliporeZEQ7000T0CCarbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation
Pipette microforge NarishigeMF-900Micropipette manufacture
Potassium Chloride (KCl)Sigma-AldrichP9541Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Pressue Pump Scientific InstrumentPV-PUMPInduce controlled pressure during experiment
Prime 95B Camera PhotometricsPrime 95B sCMOSFlourscent imaging
Rotary wheel remote unit Sensapex uM-RM3Control panel for micropipette position adjustment 
Scepter 3.0 Handheld Cell CounterMerck MilliporePHCC340KITAutomatic cell counter
Sodium Bicarbonate (NaHCO3)Sigma-AldrichS5761Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Carbonate (Na2CO3)Sigma-AldrichS2127Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9.
Sodium Chloride (NaCl)Sigma-AldrichS7653Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Sodium Phosphate Monobasic
Monohydrate (NaH2PO4 • H2O)
Sigma-AldrichS9638Tryode's  buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2
Touch screen control unit Sensapex uM-TSCControl panel for micropipette position adjustment 
X dry Objective Olympus Olympus 60x/0.70 LUCPlanFLMicropipette aspiration hardware system

References

  1. González-Bermúdez, B., Guinea, G. V., Plaza, G. R. Advances in micropipette aspiration: applications in cell biomechanics, models, and extended studies. Biophysical Journal. 116 (4), 587-594 (2019).
  2. Mierke, C. T. .

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

203

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved