A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Изучение поведения клеток при механическом напряжении имеет решающее значение для достижений в клеточной механике и механобиологии. Мы представляем метод флуоресцентной микропипеточной аспирации (fMPA), новый метод, сочетающий контролируемую механическую стимуляцию с комплексным анализом внутриклеточной сигнализации в отдельных клетках. Этот метод исследует новые углубленные исследования механобиологии живых клеток.
Аспирационные анализы с помощью микропипеток уже давно являются краеугольным камнем для исследования механики живых клеток, давая представление о клеточных реакциях на механический стресс. В данной статье подробно описывается инновационная адаптация метода аспирации микропипеток с флуоресцентной связью (fMPA). Анализ fMPA дает возможность управлять точными механическими силами при одновременном мониторинге процессов механотрансдукции живых клеток, опосредованных ионными каналами. Сложная установка включает в себя прецизионную микропипетку из боросиликатного стекла, подключенную к точно регулируемому резервуару для воды и пневматической системе аспирации, что облегчает применение контролируемого давления с шагом ± 1 мм рт. ст. Существенным усовершенствованием является интеграция эпифлуоресцентной визуализации, позволяющая одновременно наблюдать и количественно оценивать морфологические изменения клеток и внутриклеточные потоки кальция во время аспирации. Анализ fMPA, благодаря синергетическому сочетанию эпифлуоресцентной визуализации с аспирацией микропипеток, устанавливает новый стандарт для изучения клеточного механочувствия в механически сложных средах. Этот многогранный подход может быть адаптирован к различным экспериментальным установкам, обеспечивая критически важное представление о механизмах механочувствительности отдельных клеток.
Открытия в мире клеточного поведения подчеркнули роль механических стимулов, таких как растяжение, напряжение сдвига жидкости, сжатие и жесткость субстрата, в определении динамических клеточных активностей, таких как адгезия, миграция и дифференциация. Эти механобиологические аспекты имеют первостепенное значение для выяснения того, как клетки взаимодействуют с физиологической средой и реагируют на нее, влияя на различные биологические процессы 1,2.
За последнее десятилетие аспирационные анализы на основе микропипеток стали универсальным инструментом в изучении различных клеточных р....
Этот протокол соответствует руководящим принципам и был одобрен Комитетом по этике исследований на людях Сиднейского университета. Для проведения данного исследования было получено информированное согласие доноров.
1. Изоляция эритроцитов человека
Для проведения аспирационных анализов с помощью микропипеток мы сначала построили специальную камеру, состоящую из двух металлических квадратов (медь/алюминий), соединенных ручкой. Два стеклянных покровных стекла (40 мм × 7 мм × 0,17 мм) были прикреплены для создания камеры, заполненной 200 .......
Аспирационные анализы с помощью микропипеток воплощают в себе усовершенствованную методологию, использующую существенную модуляцию давления, точную пространственную оркестровку и надежное временное различение для исследования глубоких тонкостей клеточной биомеханики. В этом иссл.......
Авторы заявляют, что у них нет конкурирующих интересов, которые они могли бы сообщить в отношении настоящего исследования.
Мы благодарим Нурул Айшу Зайнал Абидин и Лауру Молдован за дополнительный набор доноров, сбор крови и поддержку флеботомии. Мы благодарим Томаса Андерсона и Ариана Насера за организацию оборудования и реагентов. Это исследование финансировалось Австралийским исследовательским советом (ARC) Discovery Project (DP200101970-L. А.Дж.); Грант Национального совета по здравоохранению и медицинским исследованиям (NHMRC) Австралии (APP2003904-L. А.Дж.); NHMRC Equipment Grant-L.A.J.; Программа наращивания потенциала в области сердечно-сосудистых заболеваний штата Новый Южный Уэльс (Грант для исследователей в начале и середине карьеры, Лос-Анджелес); Грант на исследовательские ин....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
µManager | Micro-Manager | Version 2.0.0 | |
1 mL Syringe | Terumo | 210320D | Cooperate with the Microfil |
200 µL Pipette | Eppendorf | 3123000055 | Red clood cell preparation |
22 x 40 mm Cover Slips | Knittel Glass | MS0014 | Cell chamber assembly |
50 mL Syringe | Terumo | 220617E | Connect to the water tower |
Calcium Chloride (CaCl2) | Sigma-Aldrich | C1016 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Centrifuge 5425 | Eppendorf | 5405000280 | Red clood cell preparation |
Clexane | Sigma-Aldrich | 1235820 | To prevent clotting of the collected blood. 10,000 U/mL |
DAQami | Diligent | ||
Fluorescence light source | CoolLED | pE-300 | Micropipette aspiration hardware system |
Glass capillary | Narishige | G-1 | Micropipette manufacture |
Glucose | Sigma-Aldrich | G8270 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Hepes | Thermo Fisher | 15630080 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
High speed GigE camera | Manta | G-040B | Micropipette aspiration hardware system |
High speed pressure clamp | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
High speed pressure clamp head stage | Scientific Instrument | HSPC-2-SB | Cooperate with the pressure pump |
Imaris | Oxford Instruments | ||
Inverted Microscopy | Olympus | Olympus IX83 | Micropipette aspiration hardware system |
Microfil | World Precision Instruments | MF34G-5 | 34 G (67 mm Long) Revome air bubble in the cut micropipette and test the opening of the pipette tip |
Micropipette Puller | Sutter instrument | P1000 | Micropipette manufacture |
Milli Q EQ 7000 Ultrapure Water Purification System | Merck Millipore | ZEQ7000T0C | Carbonate/bicarbonate buffer & Tryode's buffer preparation |
Pipette microforge | Narishige | MF-900 | Micropipette manufacture |
Potassium Chloride (KCl) | Sigma-Aldrich | P9541 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Pressue Pump | Scientific Instrument | PV-PUMP | Induce controlled pressure during experiment |
Prime 95B Camera | Photometrics | Prime 95B sCMOS | Flourscent imaging |
Rotary wheel remote unit | Sensapex | uM-RM3 | Control panel for micropipette position adjustment |
Scepter 3.0 Handheld Cell Counter | Merck Millipore | PHCC340KIT | Automatic cell counter |
Sodium Bicarbonate (NaHCO3) | Sigma-Aldrich | S5761 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
Sodium Carbonate (Na2CO3) | Sigma-Aldrich | S2127 | Carbonate/bicarbonate buffer preparation - 2.65 g of NaHCO3 with 2.1 g of Na2CO3 in 250 mL of Mili Q water - Final pH = 8-9. |
Sodium Chloride (NaCl) | Sigma-Aldrich | S7653 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Sodium Phosphate Monobasic Monohydrate (NaH2PO4 • H2O) | Sigma-Aldrich | S9638 | Tryode's buffer preparation - 12 mM NaHCO3, 10 mM HEPES, 0.137 M NaCl, 2.7 mM KCl, and 5.5 mM D-glucose supplemented with 1 mM CaCl2. Final pH = 7.2 |
Touch screen control unit | Sensapex | uM-TSC | Control panel for micropipette position adjustment |
X dry Objective | Olympus | Olympus 60x/0.70 LUCPlanFL | Micropipette aspiration hardware system |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved