Quantificação de Acanthamoeba spp. Motilidade

Summary

Este procedimento descreve como visualizar, rastrear e quantificar Acanthamoeba spp. motilidade.

Abstract

A ceratite por Acanthamoeba é uma infecção ocular grave que apresenta desafios de tratamento e pode levar à cegueira. Apesar de sua onipresença e potencial contaminação de lentes de contato após a exposição à água, o comportamento natural desse patógeno permanece indefinido. Compreender os padrões de movimento da Acanthamoeba pode nos informar sobre como ela coloniza as lentes de contato e contamina a córnea do paciente. É uma sorte que Acanthamoeba spp. são visíveis por microscopia de campo claro a partir de uma ampliação de 4x. Técnicas anteriores foram desenvolvidas para quantificar a motilidade de Acanthamoeba em relação aos efeitos citopáticos ou subexposição ao campo elétrico. Aqui, descrevemos um método para rastrear e quantificar Acanthamoeba spp. motilidade de longo prazo (horas a dias), que é um protocolo aplicável a várias cepas de ameba, superfícies e estado nutricional de ameba. Este procedimento é pertinente para determinar muitas quantificações de motilidade central, como distância, velocidade, confinamento e direcionalidade, que são necessárias para monitorar diferentes estágios de infecção, proliferação ou mudança comportamental.

Introduction

A pesquisa de Acanthamoeba aumentou dramaticamente nos últimos anos devido ao aumento da prevalência de ceratite por Acanthamoeba (AK), que é uma infecção parasitária após a fixação de Acanthamoeba à córnea¹. Embora os surtos de AK possam ser atribuídos a cuidados inadequados com lentes de contato ou soluções ineficazes para cuidados com lentes de contato 2,3,4,5, atualmente não há requisitos para demonstrar a eficácia da desinfecção de Acanthamoeba para qualquer produto no mercado. No entanto, há um esforço contínuo na comunidade científica e nas organizações de padrões para examinar os protocolos necessários para quantificar a eficácia da desinfecção de produtos para cuidados com lentes de contato ^6,7. Além disso, devido à sua semelhança em aspectos celulares e funcionais com macrófagos humanos, Acanthamoeba foi observado como tendo um papel significativo no hospedeiro e disseminação de outros patógenos humanos⁸, além da patogenicidade que a própria ameba traz.

Foram descritas técnicas recentes que foram capazes de quantificar a motilidade de Acanthamoeba - que geralmente não está altamente sujeita ao movimento browniano ^9,10 - em relação a efeitos citopáticos ou subexposição ao campo elétrico ^9,11, bem como avanços na análise de motilidade na pesquisa de vírus gigantes usando Acanthamoeba como vetor viral rastreável ^{12, 13}. Também houve melhorias constantes e significativas no rastreamento de células e partículas ocorrendo nos últimos 20 anos usando novos programas de software, como o software de imagem usado aqui, e novos algoritmos e tecnologias de aprendizado profundo¹⁴. No entanto, este é um campo relativamente novo e crescente da ciência em relação à pesquisa de bancada, aplicação clínica e padrões industriais, e tem havido uma escassez de dados publicados sobre métodos para visualizar e rastrear essa ameba, particularmente para quantificar mudanças comportamentais após a adesão às lentes de contato ou durante ou após a desinfecção das lentes de contato. Outros campos que se expandem para o monitoramento visual de longo prazo apoiaram esse esforço^{15 , 16 , 17} . Devido à natureza inerentemente desafiadora de Acanthamoeba - incluindo uma resistência geral a plasmídeos (que podem conferir fluorescência), a capacidade da ameba de consumir e destruir corantes celulares padrão e uma composição proteica externa única - dificultando a marcação de anticorpos - métodos disponíveis para outras células que os tornam visíveis em outros ambientes que não a imagem de campo claro têm sido inutilizáveis neste organismo. Assim, quantificar a motilidade dessa ameba demonstrou uma adição significativa ao campo. Usando o método descrito aqui, pudemos verificar que as amebas permanecem móveis por pelo menos 12 h sem nutrientes¹⁸ e que as amebas que são desafiadas com um processo de desinfecção e cessam a motilidade durante a desinfecção podem recuperar sua motilidade pós-desinfecção se não forem totalmente lisadas¹⁹.

Este protocolo detalha como rastrear e quantificar visualmente a motilidade da ameba microscopicamente. As etapas principais são registrar a ameba em campo claro usando o foco e o tempo apropriados entre as imagens, transformar as imagens em binárias usando o software de imagem e, em seguida, usar o plug-in de rastreamento de um software de imagem para definir os parâmetros experimentais e seguir cada ameba para determinar as medidas necessárias, como velocidade, distância e confinamento. Em seguida, é possível quantificar a quimiotaxia de uma ameba ou de uma população de amebas para definir a direcionalidade. A principal contribuição deste método é visualizar e quantificar o comportamento da ameba durante diferentes estados de suporte nutricional, adesão à superfície, desafio de desinfecção ou outras alterações ambientais, como coabitação com cultura de células de mamíferos.

Protocol

1. Preparação de Acanthamoeba

NOTA:Este protocolo foi verificado para ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115 e PRA-411. Este é um patógeno BSL2 e deve ser trabalhado dentro de um capô e laboratório BSL2.

1. Crie uma cultura mestre a partir de um frasco de amostra ou plugue preparado²⁰ enchendo um frasco T75 com 30 mL de meio AC6 e adicione assepticamente um plugue ou o conteúdo de um frasco de amostra a ele. Incubar o balão durante 3-5 dias a 26-30 °C até que o balão esteja 50% a 80% confluente.
2. Passe as células um dia antes de serem necessárias para criar uma população homogênea de trofozoítos.
   1. De acordo com as necessidades da cepa, agite e/ou golpeie rapidamente a cultura mestre 2x para desalojar os trofozoítos aderidos.
   2. Encher um balão T75 com 30 ml de meio AC6. Adicione 2 mL da cultura mestre à passagem. Incubar o balão durante 18-24 h a 26-30 °C.
3. Antes da colheita, inspecione visualmente a população de trofozoítos com ampliação de 4x no microscópio. Certifique-se de que os trofozoítos sejam aderentes e uniformes.
4. Bata rapidamente no frasco 2x para desalojar os trofozoítos aderidos. Despeje o conteúdo em um tubo cônico de 50 mL.
5. Gire o tubo a 500 x g por 5 min em uma centrífuga balanceada para pellet a ameba. Despeje ou pipete o meio sobrenadante e descarte. Dilua o pellet em 2-10 mL de solução de 1/4 de Ringer.
6. Vortex a amostra. Adicione 10 μL de amostra a um hemocitômetro descartável e conte o UFC/mL da Acanthamoeba.
7. Com base na contagem do hemocitômetro, diluir o pellet de ameba a uma concentração de 7,5 x 10³ células/mL em solução de Ringer a 1/4.
8. Semeie ameba em uma superfície, que pode ser de vidro, plástico ou ágar não nutriente, e uma variedade de formas de poços, dependendo das necessidades experimentais, conforme descrito abaixo.
   1. Placa de 96 poços: semeie cada poço com 200 μL de suspensão de Acanthamoeba e envolva a placa com a tampa.
   2. Placa de 48 poços: semeie cada poço com 1 mL de suspensão de Acanthamoeba e envolva a placa com a tampa.
   3. Célula de fluxo: Adicione lentamente 4 mL de suspensão de Acanthamoeba através das portas estéreis de uma célula de fluxo de alumínio estéril, evitando bolhas na câmara. Clamp as portas fechadas após a suspensão ter sido adicionada.
9. Antes da imagem, permita que a ameba adira pelo menos 30 minutos à superfície antes de iniciar o registro microscópico.

2. Visualizando e gravando Acanthamoeba

1. Visualize a ameba com ampliação de 4x em campo claro. O fundo deve aparecer cinza claro e a ameba deve ser preta. Ajuste a luz e o foco para que a ameba fique em olheiras sólidas em vez de translúcidas (ou seja, ligeiramente fora de foco, Figura 1).
   NOTA: A ampliação ideal é de 4x para rastreamento por vários motivos: As amebas que saem ou entram no campo de visão durante o rastreamento não devem ser incluídas na análise de dados, portanto, a ampliação mais baixa suporta melhor o número máximo de amebas incluídas na análise em um período de tempo. A ameba deve aparecer como círculos pretos sólidos em campo claro para convertê-los em binários para análise de rastreamento. Isso é mais fácil de conseguir com uma ampliação menor, pois ampliações mais altas revelam facilmente a natureza translúcida e as estruturas internas da ameba. Em geral, mais ameba pode ser capturada em um único campo de visão em uma ampliação menor, suportando uma análise de dados mais robusta.
2. Configure os programas de gravação no software de imagem para gravar uma imagem em intervalos regulares para rastrear a ameba. O tempo mais longo entre as imagens que permitirão um rastreamento preciso é de 30 s, o tempo ideal para o tamanho do arquivo e os detalhes de rastreamento é sugerido em 12 s ou 24 s.
3. As amebas podem ser rastreadas por vários dias de cada vez, mas esteja ciente do tamanho do arquivo que esse tipo de gravação criará e da dificuldade inerente de manipular arquivos extremamente grandes. Para evitar isso, registre amebas por seções de tempo em determinados intervalos. Por exemplo, registre por 1 h a cada 12 h por 5 dias.
4. Se o microscópio e o programa permitirem, registre vários poços em uma única sessão usando as coordenadas XY dos poços de placa ou vários locais de uma célula de fluxo. Se necessário, junte várias seções de um poço ou célula de fluxo para criar um campo de visão maior com ampliação de 4x.
   NOTA: A única restrição sobre quantos locais podem ser registrados é a rapidez com que a platina do microscópio pode se mover entre os locais dentro do tempo de intervalo da imagem (por exemplo, tirar uma imagem a cada 12 s, 24 s, etc.). No entanto, isso não é obrigatório, e o rastreamento de vídeos feitos de um único local ainda pode ter um número suficiente de faixas para uma análise estatística robusta. Um microscópio Nikon Eclipse Ti-U foi usado neste estudo, e o estágio móvel automatizado foi utilizado para registrar imagens em vários poços ao mesmo tempo. No entanto, qualquer microscópio com capacidade de gravação programável funcionará. O microscópio deve se conectar a um computador e ser capaz de gravar imagens em um programa ou disco rígido.

3. Análise do tamanho da ameba

1. Abra o microscópio file no software de imagem. As opções de importação de bioformatos serão abertas. Na caixa de diálogo, verifique se o seguinte é verdadeiro: Exibição de pilha; Ver com: Selection-Hyperstack; Gerenciamento de memória: marque Usar pilha virtual; Modo de cor: padrão.
2. Certifique-se de que nenhum dos outros menus suspensos ou caixas de seleção esteja ativado. Clique em Ok.
3. Opções de séries de bioformatos abertos. Escolha qual série é necessária. Se apenas um local for registrado por vez, provavelmente haverá apenas uma opção aqui. Clique em Ok.
4. Escolha Image > Duplicate para duplicar o único poço com o qual está sendo trabalhado de cada vez, escolhendo apenas um canal C e apenas um canal Z.
5. A partir daqui, trabalhe apenas com a imagem duplicada para manipulação e análise, não com o original. Escolha Imagem > Tipo > 8 bits. Escolha Processar > Subtrair plano de fundo.
6. Defina a bola rolante para 10,0. Verifique o fundo claro. Verifique o parabolóide deslizante.
7. Escolha Processo > Melhorar o contraste. Defina pixels saturados como 0,1% para trofozoítos ou 0,3% para um grupo de células e agregados.
8. Escolha Imagem > Ajustar > Limite (padrão > P&B). O processo Make Binary será aberto. Selecione Padrão e marque Fundo preto (de máscaras binárias).
9. Selecione o limiar agressivamente para que a maioria dos pontos de fundo não sejam visíveis, mas alguma parte de cada ameba seja visível.
10. Se o software de imagem inverteu a imagem e o fundo é branco, e a ameba é preta, vá para Editar > Inverter para corrigi-lo em um fundo preto e ameba branca.
11. Escolha Processo> Binário > Fechar, caso as células tenham um pequeno espaço na membrana externa devido a estarem fora de foco ou motilidade da célula.
12. Escolha Processar > binário > preencher furos. Remova artefatos que não sejam ameba usando as ferramentas de desenho de forma e Editar > preenchimento. Se, nesse ponto, o plano de fundo estiver branco e a ameba estiver preta, escolha Editar > Inverter. Neste ponto, a imagem deve representar as imagens binárias na Figura 2.
13. Para registrar o tamanho de cada ameba, escolha Analyze > Analyze Particles. Tamanho do conjunto: 10-Infinitiy, Circularidade: 0-1, Mostrar: Nada. Marque Exibir apenas resultados e resumir.
14. Salve os arquivos CSV exibidos. Escolha Arquivo > Salvar como > Tiff e edite o nome de acordo com a especificação desejada.

4. Preparação de arquivos de microscópio para rastreamento (análise de motilidade)

1. Abra o microscópio file no software de imagem. As opções de importação de bioformatos serão abertas.
2. Na caixa de diálogo, verifique se o seguinte é verdadeiro: Exibição de pilha; Ver com: Selection-Hyperstack. Para gerenciamento de memória, marque Usar pilha virtual. Clique em Ok.
3. As opções da série Bio-Formats serão abertas. Escolha qual série é necessária. Se apenas um local for registrado por vez, provavelmente haverá apenas uma opção aqui. Clique em Ok.
4. Escolha Imagem > Duplicar. A partir daqui, trabalhe apenas na seção duplicada do vídeo em vez de trabalhar no arquivo original.
   NOTA: Duplique a seção do vídeo que está sendo rastreada naquele momento. Para fazer isso, é preciso conhecer os quadros que correspondem aos minutos necessários para o experimento. Por exemplo, se alguém quiser rastrear a^1ª hora e tirar fotos a cada 24 s, deve haver 150 quadros na^1ª hora. Portanto, a^1ª hora será os quadros 1-150, a^2ª hora será 151-300 e assim por diante.
5. Escolha Imagem > Tipo > 8 bits. Escolha Processar > Subtrair plano de fundo. Defina a bola rolante para 10.0.
6. Verifique o fundo claro. Verifique o parabolóide deslizante. Escolha Processo > Melhorar contraste e defina-o em 0,1%.
7. Marque Todas as x# Fatias (por exemplo, todas as 150 fatias). Desmarque Normalizar. Escolha Imagem > Ajustar > Limite (padrão > P&B).
8. O processo Make Binary será aberto. Selecione Padrão. Verifique o fundo preto (das máscaras binárias).
9. Limiar agressivamente, de modo que a maioria das manchas de fundo não são visíveis, mas algumas partes da ameba são visíveis. Nesta etapa, se o plano de fundo for branco e a ameba for preta, escolha Editar > Inverter. O fundo deve ser preto e a ameba deve ser branca.
10. Escolha Processar > binário > Fechar. Escolha Processar > binário > preencher furos. Escolha Arquivo > Salvar como > Tiff e edite o nome para a especificação desejada. O arquivo agora está pronto para rastreamento.

5. Analisando a motilidade por meio de rastreamento

1. No software de imagem com o arquivo tiff necessário para rastrear, vá para Plug-ins > Rastreamento > Trackmate. A versão do Trackmate será aberta.
2. Escolha Next (Próximo). Selecione o detector LoG no menu suspenso do detector. Defina o diâmetro estimado da bolha: 35,0 mícrons, limite 1,0. Desmarque Usar filtro mediano e Fazer localização de subpixel.
3. Clique em Visualizar na primeira, no meio e nas fatias finais. Certifique-se de que todas as amebas sejam capturadas por um círculo roxo e que os defeitos ou artefatos de fundo não sejam incluídos.
4. Escolha Next (Próximo). Ele começará a ser processado e esta etapa pode levar alguns minutos para ser executada. Uma barra de detecção na parte superior da tela indicará quanto do processo está concluído.
5. Escolha Next (Próximo ) quando solicitado. No limite inicial, escolha Avançar novamente sem selecionar nada. Selecione Hyperstack Displayer ao selecionar uma exibição. Escolha Next (Próximo).
6. Defina o filtro nos pontos e escolha Avançar sem selecionar nada. Selecione um rastreador; para fazer isso, selecione Rastreador de LAP (em vez de Rastreador de LAP Simples). Escolha Next (Próximo).
7. Na vinculação quadro a quadro, defina a distância máxima para 40 μm. Na verificação de fechamento da lacuna do segmento da via Permitir fechamento da lacuna. Defina a distância máxima para isso em 100 μm e a folga máxima do quadro em 4. Não selecione nada para Divisão de segmentos de trilha ou Mesclagem de segmentos de trilha.
8. Escolha Next (Próximo). O rastreamento pode levar um tempo significativo para ser executado. Quando estiver concluído, a janela deve dizer: Rastreamento feito em x s na parte inferior. Escolha Next (Próximo).
9. Escolha Next (Avançar) novamente quando o rastreamento for concluído. Definir filtros nas faixas: selecione o sinal + no canto inferior esquerdo para adicionar um filtro para o número de pontos nas faixas. Defina o filtro como Acima para pelo menos 93% dos quadros (por exemplo, 150 quadros precisariam de um mínimo de 140 pontos).
   NOTA: Algumas versões deste software exigirão a seleção do equivalente oposto, como Abaixo pelo menos 7%, o que pode ser feito arrastando uma linha para a esquerda ou para a direita para atingir o número desejado.
10. Escolha Next (Próximo). Opções de exibição aparecerão. Certifique-se de que as faixas em cada quadro não estejam deformadas ou estranhas na maneira como a ameba está se movendo antes de salvar o arquivo XML do Trackmate ou o arquivo CSV das faixas.
11. Se uma faixa precisar ser excluída, clique em TrackScheme. O TrackScheme mostrará todas as trilhas e pontos de contato da ameba em todos os quadros.
    NOTA: Os possíveis motivos para excluir uma faixa são uma ameba entrou / saiu do campo de visão durante a gravação, uma trilha tem formato inadequado em comparação com o caminho real da ameba ou, por algum motivo, a trilha ou a ameba é um outlier nos dados de acordo com os parâmetros experimentais, etc.
12. Clique na ameba para destacar o ponto verde na tela e no Trackscheme o local terá um quadrado verde ao seu redor. Isso indicará qual trilha ou local precisa ser removido.
13. Clique com o botão direito do mouse na faixa que precisa ser removida e selecione Faixa inteira. Pressione o botão Excluir .
14. Depois de revisar todas as faixas, salve o arquivo de rastreamento clicando em Salvar no canto inferior esquerdo do pop-up do software de rastreamento. Salve o arquivo XML usando o nome do vídeo. Clique em Retomar para voltar ao pop-up do software de rastreamento.
15. Clique em Trilhas e selecione Trilhas à esquerda. Clique em Exportar para CSV e salve o arquivo CSV.
16. Se a planilha não reconhecer o CSV resultante, execute as etapas a seguir.
    1. Abra o arquivo CSV salvo no Bloco de Notas. Clique em Control + A e Control + C para copiar todo o conteúdo.
    2. Abra a planilha e clique em Control + V para colá-la na planilha. Todos os dados estarão em uma célula.
    3. Com as células com dados ainda selecionados, vá para Dados > Texto para Colunas. Escolha Delimitado > Próximo. Escolha Vírgula > Próximo > Concluir. Salve esse arquivo como o novo CSV.
17. O CSV de rastreamento terá muitos parâmetros disponíveis para análise (Figura 3). Copie e cole os parâmetros desejados em um novo arquivo CSV (Figura 4) para analisar. Os parâmetros usados aqui são descritos abaixo.
    1. Distância total percorrida: distância total percorrida por uma ameba em μm.
    2. Distância máxima percorrida: a distância máxima no caminho de uma ameba a partir de seu ponto inicial - isso pode não ser necessariamente o ponto final
       
       Onde dij é a distância de qualquer ponto I para qualquer ponto j na pista.
    3. Taxa de confinamento: A taxa de confinamento indica a eficiência de uma ameba em se afastar de seu ponto inicial: ela viajou em linha reta para longe de seu ponto inicial (um valor próximo a 1) ou ficou relativamente perto de seu ponto inicial (um valor próximo a 0).
       
    4. Velocidade média da pista: Velocidade média da ameba ao longo da distância total percorrida em mícrons por segundo.
       
    5. Deslocamento da trilha: A distância entre o ponto inicial de uma ameba e o ponto final em mícrons.
       NOTA: Todos os parâmetros de análise do software de imagem e suas definições podem ser encontrados aqui: https://imagej.net/plugins/trackmate/analyzers/. Lembre-se de que cada arquivo salvo é um resumo das faixas analisadas naquele momento. Para produzir uma análise de dados robusta, será necessário combinar adequadamente os resultados de várias réplicas, horas, etc., conforme adequado para os dados (Figura 5 e Figura 6).

Discussion

Ser capaz de rastrear e quantificar a motilidade de amebas como Acanthamoeba, que são organismos microscópicos aderentes não afetados pelo movimento browniano de baixa velocidade ^9,10, revela uma quantidade substancial de informações sobre o comportamento da ameba e pode aumentar muito o esclarecimento sobre os métodos de prevenção da CA. Esse protocolo foi detalhado em publicações recentes, e os dados foram confirmados ou combinados com outras análises de dados semelhantes ^18,19. Notamos aqui que a velocidade da ameba detalhada usando este método é semelhante ao que foi publicado por outros grupos. Este protocolo é notável por sua capacidade de ser usado basicamente em qualquer tratamento de superfície ou ameba, que é transparente à luz, mas é importante observar que, embora este protocolo possa ser modificado para funcionar com outros organismos, ele só foi otimizado até agora para Acanthamoeba. O protocolo acima funcionou consistentemente bem no laboratório, mas as seguintes alterações para alterar o método para atender a outras necessidades ou solucionar problemas de situações difíceis são fornecidas.

Determinando os parâmetros de rastreamento: No protocolo acima, foram listados a vinculação quadro a quadro, o fechamento da lacuna, a lacuna máxima do quadro e o número de pontos na pista, que eram os mais aplicáveis para publicações recentes. No entanto, é possível que outros parâmetros sejam mais adequados para outras necessidades. Além disso, pode haver parâmetros que outros gostariam de usar, mas não foram usados aqui (como a distância máxima de uma trilha em filtros de trilha). Mais informações sobre cada parâmetro e o que eles descrevem podem ser acessadas aqui no site (consulte a referência²¹). Ao decidir quais parâmetros e filtros são mais relevantes para outros experimentos e como eles devem ser definidos, pense no que é estatisticamente racional para um projeto específico; Por exemplo, alguém gostaria de dados de uma ameba que sai e depois volta para o campo de visão? Ou alguém gostaria de manter os dados de uma ameba que não se moveu muito, mas ainda foi marcada como uma faixa? e o que faz sentido para o número de quadros e o período de tempo entre os quadros em que as imagens foram gravadas.

Alterando o tamanho da bolha: Descobrimos que é extremamente difícil com qualquer software ou configuração de microscópio - com base nas tecnologias atuais e software disponível para laboratórios padrão - rastrear com precisão o número de amebas em um agregado à medida que ele muda ao longo do tempo. Se estiver rastreando o tamanho de uma bolha e tentando correlacionar esse tamanho com o número de organismos nela, use uma curva padrão gerada após experimentos repetidos para prever matematicamente o tamanho de um agregado. Por exemplo, os agregados foram criados semeando poços com uma variedade de números de ameba, como 8, 16, 32, 125, 250, 500, 1.000 e 2.000 células por poço. Imagens de lapso de tempo em vários pontos de tempo de cada poço por 24 h foram geradas. Cada esferóide (que era de um número conhecido de ameba) foi analisado para uma área bidimensional, e uma curva padrão foi gerada em função da contagem de amebas versus o tamanho do esferóide ao longo do tempo. Este experimento foi repetido em pelo menos triplicado para nos dar um desvio padrão apropriado de qualquer curva gerada.

Determinando a direcionalidade da ameba: Embora isso possa não ser necessário para estudos específicos, pode ser útil entender a direcionalidade da ameba. Isso forneceria dados sobre os efeitos quimiotáticos do tratamento ou experimento. Esses dados também podem ser usados para criar dados visuais (gráficos) e quantitativos. Isso está disponível por meio da Ferramenta de Quimiotaxia e Migração, que é um plug-in gratuito para software de imagem. Está disponível no site junto com o guia de aplicação e imagens e filmes de amostra (consulte a Tabela de Materiais).

Dinâmica de movimento detalhada: outros grupos examinaram a dinâmica de espalhamento e as trajetórias difusivas com análises estatísticas altamente avançadas e desenvolvidas além do que é discutido aqui ^9,10,22. Estes podem ser considerados com base nas necessidades do usuário.

Como acontece com qualquer método bem-sucedido, o protocolo detalhado neste manuscrito passou por muitas rodadas de solução de problemas para obter consistência. Embora excelentes vídeos rastreáveis de alta qualidade possam ser feitos tirando uma imagem a cada segundo (ou tão rápido quanto o microscópio é capaz, pode ser menos de um segundo), isso cria arquivos extremamente grandes, com os quais pode ser difícil trabalhar. Isso só é realisticamente adequado para vídeos de muito curto prazo gravados por no máximo alguns minutos. Por outro lado, ao tirar uma imagem a cada poucos segundos, descobrimos que o comportamento da ameba ainda é muito rastreável com base na velocidade dessa espécie, e é possível criar vídeos viáveis ao longo de horas ou dias. Descobrimos que a quantidade máxima de tempo entre as imagens é de 30 s, que é o tempo necessário para que a ameba seja rastreada com precisão pelo software de imagem. O intervalo de tempo que o usuário escolhe deve ser considerado usando as restrições conhecidas de quão rápido o microscópio pode gravar imagens, quantas imagens por poço são necessárias e quantos poços estão sendo registrados em cada intervalo. Da mesma forma, os parâmetros mencionados neste protocolo em relação ao deslocamento máximo, lacunas de quadros permitidas, quadros mínimos necessários e assim por diante, foram determinados por tentativa e erro por este laboratório para criar informações de trilha que incluem as faixas de ameba mais completas e ignorar o ruído criado por trilhas incompletas, ameba que se junta ou sai do palco no meio do vídeo ou erros criados por confusão de software de imagem, como quando duas amebas se encontram no meio da pista e depois se separam. Esses tipos de erros e faixas incompletas são compreensivelmente altos ao criar vídeos extremamente longos (horas a dias) de organismos biológicos microscópicos que estão constantemente interagindo uns com os outros e são a razão pela qual uma grande parte das trilhas errôneas deve ser rejeitada. Deve-se notar que a etapa de preenchimento de orifícios no protocolo é, na experiência deste laboratório, importante para reduzir o erro na forma como o software de imagem rastreia a ameba. Ao certificar-se de que cada ameba é um círculo sólido em vez de, às vezes, uma rosquinha ou uma forma de c, é muito mais provável que o software seja capaz de rastrear cada ameba com sucesso.

Além disso, conforme discutido, existem muitos parâmetros disponíveis para um usuário analisar uma imagem ou vídeo. Com base nas necessidades experimentais, temos consistentemente nos beneficiado mais da análise da distância total, distância máxima, velocidade e deslocamento. Estes são discutidos em profundidade (incluindo o uso de diferentes linhagens e superfícies) com interpretações gráficas em publicações anteriores^18,19. Esses quatro parâmetros permitem que um usuário extrapole a capacidade de uma ameba de percorrer distâncias lineares e quanto tempo leva para fazê-lo, o que ajuda a entender seu comportamento no que se refere à contaminação das lentes de contato. Recuperar e analisar esses parâmetros é um trabalho grande, conforme detalhado em nossas figuras. Ao trabalhar com planilhas grandes e numerosas a partir da saída do software de imagem, limitamos os erros não intencionais criando modelos de planilhas bloqueadas que calculavam automaticamente todas as análises necessárias. No entanto, uma possível melhoria nesse método seria escrever um script que possa lidar com esses dados, classificá-los e analisá-los.

Em conclusão, um método acessível e preciso para medir o tamanho e a motilidade de Acanthamoeba em muitas condições diferentes é descrito aqui. Demonstramos que esse método pode ser aplicado a muitas cepas diferentes de ameba e destacamos que, embora possa haver parâmetros diretos para obter informações de motilidade, essa configuração experimental pode ser altamente adaptada a quaisquer necessidades específicas.

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
¼ Ringer’s solution	ThermoFisher Scientific	BR0052G	Oxoid Ringers Solution Tablets. Follow directions to make one-quarter strength instead of full strength Ringers.
10 µL pipette	Eppendorf Research	3123000039	2 µL-20 µL single channel
10 µL pipette tips	Neptune Scientific, San Diego, CA, USA	BT10.N	10 µL Universal Barrier Tip
48 well plate	Millipore Sigma,	CLS3548	Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid
50 mL conical tubes (1 for each sample, 1 for each pass 2 sample)	Fisher Scientific	Falcon 352098	Falcon 50 mL High Clarity Conical Centrifuge Tubes, polypropylene
96-well plate	Millipore Sigma, Burlington, MA, USA	CLS3596	Corning Costar TC-Treated Multiple Well Plate: polystyrene plate, flat bottom wells, sterile, with lid
Acanthamoeba	American Type Culture Collection, Manassas, VA, USA	ATCC 30461	This protocol has been verified for ATCC 50655, 30872, 50702, 30010, 30461, 50370, 50703, 30137, PRA-115, and PRA-411
Axenic culture media (AC6)	Made in house	n/a	Containing 20 g biosate peptone, 5 g glucose, 0.3 g KH2PO4, 10 µg vitamin B12, and 1 glass5 mg l-methionine per liter of distilled deionized water. Adjust pH to 6.6-6.95 with 1 M NaOH and autoclave at 121 °C for 20 min, store at room temperature for up to 3 months.
Centrifuge and appropriate rotor	Thermo Scientific, Waltham, MA, USA	Sorvall ST 40R	Any equivalent centrifuge and rotor are acceptable so long as it can spin 50 mL conical tubes at 500 x g for 5 min
Chemotaxis and Migration Tool			Free software based on ImageJ, available at https://ibidi.com/chemotaxis-analysis/171-chemotaxis-and-migration-tool.html
Disposable hemocytometer	Bulldog Bio, Portsmouth, NH, USA	DHC-N01	Neubauer Improved 2-Chip Disposable Hemocytometer, Individually packaged, Nonpyrogenic
ImageJ software with Trackmate plugin (this protocol written with Trackmate version 6.0.2.)			Free software developed by the National Institutes of Health, available at imagej.net. Trackmate plugin available at https://imagej.net/plugins/trackmate/
Microscope, preferably with automated moveable stage	Nikon, Tokyo, Japan		A Nikon Eclipse Ti-U Microscope was used in this study and the automated moveable stage was utilized to be able to record images in multiple wells at a time.
NIS-Elements software	Nikon
Serological pipette	Fisher Scientific, Hampton, NH, USA	BrandTech 26331	BrandTech accu-jet pro Pipet Controller
Serological pipette tips	VWR	5 mL: 76201-710 10 mL: 170356 25 mL: 89130-900 50 mL: 75816-088	VWR Serological Pipette, Non-Pyrogenic
Sterile aluminum transmission flow cell	Biosurface Technologies Corporation, Bozeman, MT, USA	FC 81-AL	Anodized aluminum single channel transmission flow cell with 96-well plate footprint for use with an inverted microscope
T75 Flasks	VWR, Radnor, PA, USA	734-2316	VWR Tissue Culture Flask, 182.5 cm, Surface treated, Plug seal cap, Sterile