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Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico (AR) encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Ao adicionar o RA aprovado pela FDA à nanoemulsão, a sIgA específica do antígeno foi promovida na vagina e no intestino delgado após a injeção intramuscular da nanoemulsão.
As nanoestruturas catiônicas surgiram como um adjuvante e sistema de entrega de antígenos que aumenta a maturação das células dendríticas, a geração de ROS e a captação de antígenos e, em seguida, promove respostas imunes específicas do antígeno. Nos últimos anos, o ácido retinóico (AR) tem recebido atenção crescente devido ao seu efeito na ativação da resposta imune da mucosa; no entanto, para usar a AR como adjuvante da mucosa, é necessário resolver o problema de sua dissolução, carregamento e entrega. Aqui, descrevemos um sistema de entrega de ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica (CNE-RA) composto pelo lipídio catiônico 1,2-dioleoil-sn-glicero-3-fosfocolina (DOTAP), ácido retinóico, esqualeno como fase oleosa, polissorbato 80 como surfactante e trioleato de sorbitano 85 como co-surfactante. Suas propriedades físicas e químicas foram caracterizadas usando espalhamento dinâmico de luz e um espectrofotômetro. A imunização de camundongos com a mistura de antígeno (ovalbumina, OVA) e CNE-RA elevou significativamente os níveis de imunoglobulina A secretora anti-OVA (sIgA) no fluido de lavagem vaginal e no fluido de lavagem do intestino delgado de camundongos em comparação com OVA sozinho. Este protocolo descreve um método detalhado para a preparação, caracterização e avaliação do efeito adjuvante do CNE-RA.
Os adjuvantes são frequentemente usados para aumentar a eficácia de uma vacina, estimulando o sistema imunológico a responder mais fortemente à vacina, aumentando assim a imunidade a um patógeno específico1. O adjuvante de nanoemulsão (NE) refere-se a um sistema de dispersão coloidal com estabilidade termodinâmica, emulsificando uma certa proporção da fase oleosa e da fase aquosa para produzir uma emulsão na forma de água em óleo (A/O) ou óleo em água (O/A)2. O adjuvante de nanoemulsão O/A pode produzir citocinas e quimiocinas no local da injeção, induzir a rápida agregação e proliferação de células imunes importantes, c....
Os experimentos com animais foram realizados de acordo com o Guia para o Uso e Cuidados com Animais de Laboratório e aprovados pelo Comitê de Ética e Bem-Estar de Animais de Laboratório da Terceira Universidade Médica Militar.
1. Preparação de nanoemulsões (EN)
No total, quatro formulações de nanoemulsão foram preparadas e caracterizadas por seu tamanho de partícula (Figura 1), seu potencial zeta e sua eficiência de encapsulação, conforme apresentado na Tabela 2. O tamanho da partícula foi concentrado em torno de 160-190nm e a adição de DOTAP reverteu o potencial Zeta da nanoemulsão. A IgG sérica específica para OVA e seu nível de anticorpos de subgrupo no soro foram detectados 2 semanas após a terceira imunização........
Neste protocolo, desenvolvemos um ácido retinóico encapsulado em nanoemulsão catiônica para ser usado como adjuvante para promover respostas sistêmicas e mucosas específicas do antígeno. Comparado aos adjuvantes NE tradicionais, tem as duas vantagens a seguir. Em primeiro lugar, em geral, a superfície das EN O/A tem uma carga negativa elevada, o que dificulta a carga direta dos antigénios. As EN catiônicas podem efetivamente adsorver antígenos peptídicos ou proteicos e aumentar a imunogenicidade específica. .......
Este estudo foi financiado pelo Programa-Chave da Fundação de Ciências Naturais de Chongqing (nº cstc2020jcyj-zdxmX0027) e pelo Projeto da Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (nº 32270988).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
1640 medium | GIBCO, USA | C11875500BT | |
450 nm Stop Solution for TMB Substrate | Abcam | ab171529-1000 mL | |
Automated Cell Counter | Countstar, China | IC1000 | |
BSA | Sigma-Aldrich, USA | B2064-100G | |
Centrifuge 5810 R | Eppendorf, Germany | 5811000398 | |
Danamic Light Scattering | Malvern | Zetasizer Nano S90 | |
DOTAP | CordenPharma, Switzerland | O02002 | |
ELISpot Plus: Mouse IFN-gamma (ALP) | mabtech | ab205719 | |
Fetal Bovine Serum | GIBCO, USA | 10099141C | |
Full-function Microplate Reader | Thermo Fisher Scientific, USA | VL0000D2 | |
Goat Anti-Mouse IgG1(HRP) | Abcam | ab97240-1mg | |
Goat Anti-Mouse IgA alpha chain (HRP) | Abcam | ab97235-1mg | |
Goat Anti-Mouse IgG H&L (HRP) | Abcam | Ab205720-500ug | |
Goat Anti-Mouse IgG2a heavy chain (HRP) | Abcam | ab97245-1mg | |
High pressure homogenizer | ATS | ||
MONTANE 85 PPI | SEPPIC, France | L12910 | |
MONTANOX 80 PPI | SEPPIC, France | 36372K | |
OVA257–264 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
OVA323-339 | Shanghai Botai Biotechnology Co., Ltd. | NA | |
Phosphate buffer saline | ZSGB-bio | ZLI-9061 | |
Red Blood Cell Lysis Buffer | Solarbio, China | R1010 | |
retinoic acid | TCI, Japan | TCI-R0064-5G | |
Squalene | Sigma, USA | S3626 | |
T10 basic Ultra-Turrax | IKA, Germany | ||
TMB ELISA Substrate | Abcam | ab171523-1000ml | |
trypsin inhibitor | Diamond | A003570-0100 | |
Tween-20 | Macklin, China | 9005-64-5 | |
Ultraviolet spectrophotometer | Hitachi | U-3900 |
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