A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
* These authors contributed equally
Здесь мы представляем экспериментальный эволюционный протокол для адаптации у термофилов с использованием недорогих, энергоэффективных настольных термомиксеров в качестве инкубаторов. Этот метод продемонстрирован на основе характеристики температурной адаптации у Sulfolobus acidocaldarius, архея с оптимальной температурой роста 75 °C.
Архей Sulfolobus acidocaldarius стал перспективной теплолюбивой модельной системой. Изучение того, как термофилы приспосабливаются к изменению температуры, является ключевым требованием не только для понимания фундаментальных эволюционных процессов, но и для разработки S. acidocaldarius в качестве шасси для биоинженерии. Одним из основных препятствий для проведения экспериментальной эволюции с помощью термофилов является стоимость обслуживания оборудования и использование энергии традиционными инкубаторами для высокотемпературного выращивания. Для решения этой проблемы представлен всеобъемлющий экспериментальный протокол для проведения экспериментальной эволюции S. acidocaldarius с использованием недорогих и энергоэффективных настольных термомиксеров. Протокол включает в себя метод периодического культивирования с относительно небольшими объемами (1,5 мл), что позволяет отслеживать адаптацию в нескольких независимых линиях. Этот метод легко масштабируется за счет использования дополнительных термомиксеров. Такой подход повышает доступность S. acidocaldarius в качестве модельной системы за счет снижения как первоначальных инвестиций, так и текущих затрат, связанных с экспериментальными исследованиями. Кроме того, этот метод может быть перенесен на другие микробные системы для изучения адаптации к различным условиям окружающей среды.
Ранняя жизнь на Земле могла возникнуть в экстремальных условиях, таких как гидротермальные жерла, которые характеризуются чрезвычайно высокими температурами икислотностью. Микробы продолжают обитать в экстремальных условиях, включая горячие источники и вулканическую сольфатару. Характеристика эволюционной динамики, происходящей в этих экстремальных условиях, может пролить свет на специализированные физиологические процессы, которые обеспечивают выживание в этих условиях. Это может иметь далеко идущие последствия, от нашего понимания истоков биологического разнообразия до разработки новых высокотемпературных фер....
1. Приготовление питательной среды S. acidocaldarius (BBM+)
ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования S. acidocaldarius по этому протоколу используется базальная среда Брока (BBM+)23. Его готовят путем объединения неорганических исходных ра.......
Измерения кривой роста
Кривые роста S. acidocaldarius DSM639 показаны на рисунке 3A. Было обнаружено, что рост аналогичен при сравнении инкубации с использованием термомиксеров и в обычных инкубаторах. Параметры средних темпов роста оценивались п.......
В этой работе был разработан протокол экспериментальной эволюции термофилов, в данном случае адаптированный для архея S. acidocaldarius, но адаптированный к другим микробам с высокими требованиями к высокотемпературному росту. Этот протокол основан на методах, первона.......
Авторы не заявляют о конфликте интересов.
Авторы благодарят профессора С.В. Альберса (Университет Фрайбурга), профессора Эвелин Петерс (Свободный университет Брюсселя) и доктора Рани Баеса (Свободный университет Брюсселя) за советы и штамм S. acidocaldarius DSM639. Эта работа была профинансирована исследовательским грантом Королевского общества (присужденным DRG: RGS\R1\231308), исследовательским грантом UKRI-NERC «Исследование границ» (присужденным DRG и CGK: NE/X012662/1) и стипендией доктора философии Кувейтского университета (присужденной ZA).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.22 μm syringe-driven membrane filters | StarLab | E4780-1226 | For filter sterilising media components that cannot be autoclaved. |
1 μL inoculation loops | Greiner | 731161, 731165, or 731101 | For inoculating cultures. Other loops can be used. |
1000 μL pipette tips | StarLab | S1111-6811 | Other pipette tips can be used. |
2 mL microcentrifuge tubes | StarLab | S1620-2700 | For culturing S. acidocaldarius in thermomixers. |
200 μL pipette tips | StarLab | S1111-0816 | Other pipette tips can be used. |
50 mL polystyrene tubes with conical bottom | Corning | 430828 or 430829 | Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. |
50 mL syringe | BD plastipak | 300865 | For use with syringe-driven filters. |
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom) | Nunc | 260860 | For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer. |
Adjustable width multichannel pipette | Pipet-Lite | LA8-300XLS | Optional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates. |
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4) | Millipore | 168355 | For Brock stock solution I. |
Autoclave | Priorclave | B60-SMART or SV100-BASE | Other autoclaves can also be used. |
Breathe-EASY gas permeable sealing membrane | Sigma-Aldrich | Z763624-100EA | Cut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C |
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | C3306 | For Brock stock solution I. |
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated) | Greiner | M9062 | Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures. |
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O) | Supelco | 1025560100 | For Trace element stock solution. |
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O) | Sigma-Aldrich | 307483 | For Trace element stock solution. |
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6) | Thermo Scientific Chemicals | 11462858 | Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication) |
Double-distilled water (ddH2O) | |||
Gelrite | Duchefa Biochemie | G1101.1000 | Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point. |
Glass 100 mm Petri dishes | Brand | BR455742 | Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures. |
Incubator | New Brunswick | Innnova 42R | Other incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C. |
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O) | Supelco | 103943 | For Fe Stock Solution |
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 230391 | For Brock stock solution I. |
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O) | Sigma-Aldrich | SIALM5005-100G | For Trace element stock solution. |
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy Monitoring | Tapo | Tapo P110 | To monitor energy consumtion |
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate | Sigma-Aldrich | C0626-500G | N-Z-Amine-A is used as a source of amino acids. |
Paper clip (or other sturdy wire) | none | none | For piercing 2 mL microcentrifuge tubes. |
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4) | Sigma-Aldrich | P0662 | For Brock stock solution I. |
Promega Wizard Genomic DNA Purification Kit | Promega | A1120 | Optional, to extract genomic DNA in the lab |
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | M1651-100G | For Trace element stock solution. |
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O) | Sigma-Aldrich | S9640 | For Trace element stock solution. |
Spectrophotometer | BMG | SPECTROstar OMEGA | For measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used. |
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4) | Thermo Scientific Chemicals | 11337588 | Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3. |
Thermomixer | DLab | HM100-Pro | Other thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM |
Uracil (C4H4N2O2) | Sigma-Aldrich | U0750 | Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains. |
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O) | Sigma-Aldrich | 204862 | For Trace element stock solution. |
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O) | Sigma-Aldrich | 221376 | For Trace element stock solution. |
Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article
Request PermissionExplore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved