Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Здесь мы представляем экспериментальный эволюционный протокол для адаптации у термофилов с использованием недорогих, энергоэффективных настольных термомиксеров в качестве инкубаторов. Этот метод продемонстрирован на основе характеристики температурной адаптации у Sulfolobus acidocaldarius, архея с оптимальной температурой роста 75 °C.

Abstract

Архей Sulfolobus acidocaldarius стал перспективной теплолюбивой модельной системой. Изучение того, как термофилы приспосабливаются к изменению температуры, является ключевым требованием не только для понимания фундаментальных эволюционных процессов, но и для разработки S. acidocaldarius в качестве шасси для биоинженерии. Одним из основных препятствий для проведения экспериментальной эволюции с помощью термофилов является стоимость обслуживания оборудования и использование энергии традиционными инкубаторами для высокотемпературного выращивания. Для решения этой проблемы представлен всеобъемлющий экспериментальный протокол для проведения экспериментальной эволюции S. acidocaldarius с использованием недорогих и энергоэффективных настольных термомиксеров. Протокол включает в себя метод периодического культивирования с относительно небольшими объемами (1,5 мл), что позволяет отслеживать адаптацию в нескольких независимых линиях. Этот метод легко масштабируется за счет использования дополнительных термомиксеров. Такой подход повышает доступность S. acidocaldarius в качестве модельной системы за счет снижения как первоначальных инвестиций, так и текущих затрат, связанных с экспериментальными исследованиями. Кроме того, этот метод может быть перенесен на другие микробные системы для изучения адаптации к различным условиям окружающей среды.

Introduction

Ранняя жизнь на Земле могла возникнуть в экстремальных условиях, таких как гидротермальные жерла, которые характеризуются чрезвычайно высокими температурами икислотностью. Микробы продолжают обитать в экстремальных условиях, включая горячие источники и вулканическую сольфатару. Характеристика эволюционной динамики, происходящей в этих экстремальных условиях, может пролить свет на специализированные физиологические процессы, которые обеспечивают выживание в этих условиях. Это может иметь далеко идущие последствия, от нашего понимания истоков биологического разнообразия до разработки новых высокотемпературных фер....

Protocol

1. Приготовление питательной среды S. acidocaldarius (BBM+)

ПРИМЕЧАНИЕ: Для культивирования S. acidocaldarius по этому протоколу используется базальная среда Брока (BBM+)23. Его готовят путем объединения неорганических исходных ра.......

Representative Results

Измерения кривой роста
Кривые роста S. acidocaldarius DSM639 показаны на рисунке 3A. Было обнаружено, что рост аналогичен при сравнении инкубации с использованием термомиксеров и в обычных инкубаторах. Параметры средних темпов роста оценивались п.......

Discussion

В этой работе был разработан протокол экспериментальной эволюции термофилов, в данном случае адаптированный для архея S. acidocaldarius, но адаптированный к другим микробам с высокими требованиями к высокотемпературному росту. Этот протокол основан на методах, первона.......

Acknowledgements

Авторы благодарят профессора С.В. Альберса (Университет Фрайбурга), профессора Эвелин Петерс (Свободный университет Брюсселя) и доктора Рани Баеса (Свободный университет Брюсселя) за советы и штамм S. acidocaldarius DSM639. Эта работа была профинансирована исследовательским грантом Королевского общества (присужденным DRG: RGS\R1\231308), исследовательским грантом UKRI-NERC «Исследование границ» (присужденным DRG и CGK: NE/X012662/1) и стипендией доктора философии Кувейтского университета (присужденной ZA).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm syringe-driven membrane filtersStarLabE4780-1226For filter sterilising media components that cannot be autoclaved.
1 μL inoculation loopsGreiner731161, 731165, or 731101For inoculating cultures. Other loops can be used.
1000 μL pipette tipsStarLabS1111-6811Other pipette tips can be used.
2 mL microcentrifuge tubesStarLabS1620-2700For culturing S. acidocaldarius in thermomixers.
200 μL pipette tipsStarLabS1111-0816Other pipette tips can be used.
50 mL polystyrene tubes with conical bottomCorning430828 or 430829Other tubes may be used. Check performance at 75 °C. Tubes with plug seal caps may not allow sufficient aeration; check before using. 
50 mL syringeBD plastipak300865For use with syringe-driven filters.
96 well microtitre plates (non-treated, flat bottom)Nunc260860For measuring OD at 600 nm in spectrophotometer.
Adjustable width multichannel pipettePipet-LiteLA8-300XLSOptional, but saves time when transferring between microcentrifuge and 96 well plates.
Ammonium sulfate ((NH4)2SO4)Millipore168355For Brock stock solution I.
AutoclavePriorclaveB60-SMART or SV100-BASEOther autoclaves can also be used.
Breathe-EASY gas permeable sealing membraneSigma-AldrichZ763624-100EACut to size to use on pierced microcentrifuge tubes. If substituting other gas permeable memrbanes, ensure performance is adequate at 75 °C
Calcium chloride dihydrate (CaCl2·2H2O)Sigma-AldrichC3306For Brock stock solution I.
CELLSTAR Six well plates (suspension/non-treated)GreinerM9062Other manufacturers' six well plates can likely be substituted. Check performance at high temperatures.
Cobalt(II) sulfate heptahydrate (CoSO4·7H2O)Supelco1025560100For Trace element stock solution.
Copper(II) chloride dihydrate (CuCl2·2H2O)Sigma-Aldrich307483For Trace element stock solution.
D-(+)-glucose anhydrous (C6H12O6)Thermo Scientific Chemicals11462858Other pentose and hexose sugars may also be used (e.g. D-xylose, D-arabinose). Glucose is not a preferred carbon source for S. acidocaldarius (SV Albers, personal communication)
Double-distilled water (ddH2O)
GelriteDuchefa BiochemieG1101.1000Gelrite (gellan gum) is used in place of agar to make solid media due to its higher melting point.
Glass 100 mm Petri dishesBrandBR455742Glass Petri dishes are used because most standard polystyrene 90 mm Petri dishes deform at 75 °C (brand-dependent). Alternatively, six well plates can be used as these do not deform at high temperatures.
IncubatorNew BrunswickInnnova 42ROther incubators can also be used. Check the operating temperature for equipment prior to purchase/use, as many incubators are not capable of temperatures higher than 65°C.
Iron(III) chloride hexahydrate (FeCl3·6H2O)Supelco103943For Fe Stock Solution
Magnesium sulfate heptahydrate (Epsom salt) (MgSO4·7H2O)Sigma-Aldrich230391For Brock stock solution I.
Manganese(II) chloride tetrahydrate (MnCl2·4H2O)Sigma-AldrichSIALM5005-100GFor Trace element stock solution.
Mini Smart Wi-Fi Socket, Energy MonitoringTapoTapo P110To monitor energy consumtion 
N-Z-Amine A - Casein enzymatic hydrolysate Sigma-AldrichC0626-500GN-Z-Amine-A is used as a source of amino acids.
Paper clip (or other sturdy wire)nonenoneFor piercing 2 mL microcentrifuge tubes.
Potassium dihydrogen phosphate (Monopotassium phosphate) (KH2PO4)Sigma-AldrichP0662For Brock stock solution I.
Promega Wizard Genomic DNA Purification KitPromegaA1120Optional, to extract genomic DNA in the lab
Sodium molybdate dihydrate (Na2MoO4·2H2O)Sigma-AldrichM1651-100GFor Trace element stock solution.
Sodium tetraborate decahydrate (Borax) (Na2B4O7·10H2O)Sigma-AldrichS9640For Trace element stock solution.
SpectrophotometerBMGSPECTROstar OMEGAFor measuring OD at 600 nm. Other spectrophotometers that can read OD at 600 nm can be used.
Sulfuric acid (Diluted in a 1:1 ratio with water) (H2SO4)Thermo Scientific Chemicals11337588Used to adjust pH of Brock stock solution II/III to a final pH of 2–3.
ThermomixerDLabHM100-ProOther thermomixers can also be used; key consideration is the ability to maintain 65–75 °C temperatures and 400 RPM
Uracil (C4H4N2O2)Sigma-AldrichU0750Deletion of pyrE is a common genetic marker used in S. acidocaldarius. Deletion strains must be supplemented with uracil for growth. Supplementation is not strictly required for the DSM639 wild-type strain, but is included here as future experiments may involve deletion strains.
Vanadyl sulfate dihydrate (VOSO4·2H2O)Sigma-Aldrich204862For Trace element stock solution.
Zinc sulfate heptahydrate (ZnSO4·7H2O)Sigma-Aldrich221376For Trace element stock solution.

References

  1. Nisbet, E. G., Sleep, N. H. The habitat and nature of early life. Nature. 409 (6823), 1083-1091 (2001).
  2. Buckling, A., Craig Maclean, R., Brockhurst, M. A., Colegrave, N. The Beagle in a bottle. Nature. 457 (7231), 824-829 (2009).
  3. Lenski, ....

Explore More Articles

Sulfolobus acidocaldarius

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved