הערכת רגישות מבנית של אזורים לא מסודרים במהותם בתגובה לעקה היפראוסמוטית בתאים חיים באמצעות FRET

Summary

אזורים לא מסודרים מהותיים (IDR) הם תחומי חלבון גמישים המשנים את הקונפורמציה שלהם בתגובה לשינויים סביבתיים. Ensemble Fluorescence Resonance Energy Transfer (FRET) יכול להעריך את ממדי החלבונים בתנאים שונים. אנו מציגים גישת FRET להערכת רגישות מבנית IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים תחת לחץ היפראוסמוטי.

Abstract

אזורים בעלי הפרעה פנימית (IDR) הם תחומים חלבוניים המשתתפים בתהליכים תאיים חיוניים. במהלך תנאי עקה, התכונות הפיזיקוכימיות של הסביבה התאית משתנות, ומשפיעות ישירות על ההרכב הקונפורמטיבי של IDRs. IDR רגישים מטבעם להפרעות סביבתיות. חקר האופן שבו התכונות הפיזיקוכימיות של התא מווסתות את ההרכב הקונפורמטיבי של IDR חיוני להבנת הבקרה הסביבתית של תפקודם. במאמר זה אנו מתארים שיטה שלב אחר שלב למדידת הרגישות המבנית של IDR בתאי Saccharomyces cerevisiae חיים בתגובה לתנאי עקה היפראוסמוטיים. אנו מציגים את השימוש בהעברת אנרגיית תהודה פלואורסצנטית (FRET) כדי להעריך כיצד הממדים הגלובליים של IDR משתנים במהלך עלייה הדרגתית של לחץ היפראוסמוטי המוטל על תאים עם אוסמוליט כלשהו. בנוסף, אנו מספקים סקריפט לעיבוד מדידות פלואורסצנטיות והשוואת רגישות מבנית עבור IDR שונים. על ידי ביצוע שיטה זו, חוקרים יכולים לקבל תובנות חשובות לגבי השינויים הקונפורמטיביים שעוברים IDR בסביבה התוך-תאית המורכבת בסביבות משתנות.

Introduction

אזורים בעלי אי-סדר פנימי (IDR) הם מרכיבים קריטיים בתהליכים תאיים¹. בשילוב עם תחומים מובנים, IDR חיוניים לתפקודי חלבון. הרכב חומצות האמינו של IDR מוטה, ומיוצג בעיקר על ידי שאריות טעונות, הידרופיליות וקטנות. בגלל מאפיין זה, IDR נחשבים לתחומים בעלי מורכבות נמוכה ^2,3. IDR רבים משכו תשומת לב, בעיקר משום שאזורים אלה ממלאים תפקיד מכריע במצבים פתולוגיים, במיוחד מחלות נוירודגנרטיביות. מחלות כאלה מאופיינות על ידי הרכבה עצמית ולאחר מכן תצהיר חוץ תאי או תוך תאי של IDR בנוירונים⁴. דוגמאות ל-IDR כאלה כוללות β עמילואיד (Aβ) במחלת אלצהיימר, הנטינגטין (HTT) במחלת הנטינגטון, וחלבו....

Protocol

1. מבנה פלסמיד

1. הגבר את מסגרת הקריאה הפתוחה (ORF) המקודדת עבור IDR הרצוי על ידי תגובת שרשרת פולימראז (PCR). אל תכלול את קודון העצירה מכיוון שה- ORF יהיה מוקף בגנים המקודדים את החלבונים הפלואורסצנטיים. עבור ההגברה, עצבו פריימרים עם אתרי הגבלה SacI (5') ו-BglII (3').
   הערה: עבור מקטע התו.......

Discussion

השיטה המוצגת כאן מציעה דרך לקבל תובנות כיצד הממדים הגלובליים של אנסמבל ה- IDR חשים ומגיבים להפרעות סביבתיות. שיטה זו מסתמכת על מבנה מקודד גנטית ואינה דורשת רכיבים נוספים מעבר לביטוי יציב של פלסמיד בתאי שמרים, מה שהופך אותה לניתנת להתאמה ליישומים פוטנציאליים בסוגי תאים אחרים. יתר על כן, הוא ר.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate	Greiner Bio-One	655096
Agar	Sigma-Aldrich	5040
BglII	New England BioLabs	R0144S
BJ5465 cells	American Type Culture Collection	208289
Buffer MES 50 mM	Sigma-Aldrich	M8250
Buffer Tris-HCl 10 mM	Invitrogen	15506017
EDTA 1 mM	Merck	108452
Falcon tubes	Corning	352057
LB media	Sigma-Aldrich	L2897
Lithium acetate 0.1 M	Sigma-Aldrich	L6883
Low Melt Agarose	GOLDBIO	A-204-25
Microcentrifuge	eppendorf	5452000010
Miniprep kit	ZymoPure	D4210
NaOH 0.02 M	Merck	106462
PEG 3,350 40%	Sigma-Aldrich	1546547
plasmid pDRFLIP38-AtLEA4-5	addgene	178189
Plate reader	BMG LABTECH	CLARIOstar Plus
SacI	New England BioLabs	R3156S
Salmon sperm DNA 2 mg/mL	Thermo Fisher Scientific	15632011
SD-Ura	Sigma-Aldrich	Y1501
Sodium cloride	Sigma-Aldrich	S9888
Taq polymesare	Promega	M5123
Transiluminator	Accuris instruments	E4000
UV-Visible spectrophotometer	Thermo Fisher Scientific	Biomate3
YPD media	Sigma-Aldrich	Y1500