Восстановление внутрисонной артерии на мышиной модели после инъекции возвращает кровоток к артерии, не оказывая негативного влияния на распределение введенного материала. Восстановление места инъекции облегчает последующие инъекции через ту же артерию и предотвращает ишемию головного мозга у линий мышей, у которых отсутствует полный круг Виллиса.
Учитывая последние достижения в области доставки новых противоопухолевых препаратов с использованием эндоваскулярных селективных методов внутриартериальной доставки в нейроонкологии, существует острая необходимость в разработке методов внутрисонных инъекций на мышиных моделях, включая методы восстановления сонной артерии у мышей после инъекции для обеспечения последующих инъекций. Мы разработали метод интракаротидной инъекции в мышиной модели для доставки терапевтических препаратов во внутреннюю сонную артерию (ВСА) с помощью двух альтернативных процедур.
Во время инъекции игла вводится в общую сонную артерию (ОСА) после наложения шва вокруг наружной сонной артерии (ЭКА) и вводимые терапевтические препараты вводятся в ВСА. После инъекции общая сонная артерия (ОСА) может быть перевязана, что ограничивает количество интракаротидных инъекций до одной. Альтернативная процедура, описанная в этой статье, включает в себя модификацию, при которой инъекция внутрисонной артерии сопровождается восстановлением места инъекции ОСА, что восстанавливает кровоток внутри ОСА и позволяет избежать осложнения в виде ишемии головного мозга, наблюдаемого на некоторых моделях мышей.
Мы также сравнили доставку мезенхимальных стволовых клеток человека (BM-hMSCs), полученных из костного мозга, с внутричерепными опухолями при доставке через интракаротидную инъекцию с восстановлением места инъекции и без нее после инъекции. Доставка БМ-МСК существенно не отличается между методами. Наши результаты показывают, что восстановление места инъекции ОСА позволяет проводить повторные инъекции через одну и ту же артерию и не ухудшает доставку и распределение введенного материала, тем самым обеспечивая модель с большей гибкостью, которая более точно имитирует интракаротидную инъекцию у человека.
Доставка терапевтических препаратов к опухолям головного мозга затруднена из-за непроницаемости гематоэнцефалического барьера (ГЭБ) и гематоэнцефалического барьера (БТБ). Прямое внутриопухолевое введение терапевтических средств для обхода ГЭБ может быть достигнуто путем использования резервуарного катетера Ommaya, микроинфузии с низкой скоростью потока для доставки с усиленной конвекцией или местной инъекции в резекционную полость или прилегающие ткани1. Однако общий объем опухолевой ткани, который достигается с помощью этих методов, ограничен 2,3,4. Внутриартериальные инъекции ранее использовались для доставки терапевтических агентов к опухолям головного мозга с целью охвата большей части опухоли 5,6,7,8, а в последнее время достижения как в методах внутриартериальной доставки, так и в новых терапевтических агентах продемонстрировали преимущества использования этого подхода в лечении опухолей головного мозга7. 9. Эти достижения включают разработку микрокатетеров, эндоваскулярную селективную внутриартериальную доставку (ЭСИА) с усовершенствованной визуализацией, использование осмотических агентов для разрушения ГЭБ и БТБ, а также разработку таргетной биологической терапии. Таким образом, для проведения доклинических испытаний новых терапевтических агентов, вводимых посредством внутриартериальных инъекций, необходимы соответствующие модели трансляционных исследований 9,10.
На мышиных моделях опухолей головного мозга терапевтические агенты, вводимые внутрибрюшинно или внутривенно (через хвостовую вену), проходят через печень или сердце и легкие, соответственно, прежде чем распространяться по всему организму, включая мозг. Эти эффекты первого прохождения могут захватывать и удалять агент или разбавлять агент до того, как он достигнет мозга, и могут представлять собой дозоограничивающую токсичность до достижения терапевтической дозы в мозге. Напротив, инъекция внутрисонной артерии обеспечивает целенаправленную доставку в мозг до начала кровообращения, минуя метаболизм первого прохождения и ограничивая нецелевую доставку. В то время как внутрисонная инъекция мышам является более трудоемкой, специфичность и воспроизводимость метода приводят к сокращению количества животных для завершения исследований 11,12.
В целом, при ранее описанных способах инъекции внутрисонной артерии у мышей общая сонная артерия перевязывается после инъекции, а кровообращение в мозг обеспечивается контралатеральной сонной артерией и задним мозговым кровообращением через кругВиллиса 11,12. Этот метод имеет неотъемлемое ограничение, позволяющее сделать максимум одну инъекцию во внутреннюю или внешнюю сонную артерию. Также важно, чтобы линии мышей, используемые в экспериментах с перевязкой сонной артерии, имели полный Виллис круг для предотвращения ишемии головного мозга из-за перевязанной артерии13. Также было продемонстрировано, что окклюзия сонной артерии снижает мозговой кровоток и ограничивает распределение вводимых частиц14. Кроме того, окклюзия сонной артерии у мышей после инъекции не имитирует инъекцию внутрисонной артерии у людей.
Наша группа ранее использовала инъекции внутрисонной артерии для успешной доставки мезенхимальных стволовых клеток в мозг 10,15,16,17,18,19. В этой статье мы подробно описываем этот метод инъекции интракаротидной артерии и включаем модификацию разработанного нами метода, при котором место инъекции восстанавливается без окклюзии артерии, избегая ограничений, связанных с постинъекционным лигированием сонной артерии. При этом методе общая сонная артерия (ОЦА) подготавливается к инъекции путем наложения двух швов, по одному на каждом конце предполагаемого места инъекции, а нижний шов (ниже места инъекции) затягивается. Наружная сонная артерия (ЭКА) пломбируется с помощью другого шва. Игла вводится в ОСА, а терапевтические препараты доставляются во внутреннюю сонную артерию (ВСА). После этого верхний шов на ОСА затягивается, чтобы предотвратить обратный отток из ВСА. На этом этапе введенный ОСА может быть либо перевязан, либо восстановлен. Если ОСА необходимо перевязать, швы затягиваются и остаются на месте. Если место инъекции восстановлено, после операции снимаются швы, восстанавливается кровоток. Подробная информация об этих альтернативных процедурах представлена ниже.
Все шаги, описанные ниже, соответствуют нашему протоколу, который соответствует рекомендациям, установленным и одобренным Комитетом по институциональному уходу за животными и их использованию в Онкологическом центре им. М. Д. Андерсона Техасского университета.
1. Подготовка операционного стола и мыши к хирургическому вмешательству
2. Хирургическое вмешательство (Рисунок 2, Рисунок 3, Рисунок 4, Рисунок 5, Рисунок 6 и Рисунок 7)
Предыдущие исследования показали, что мезенхимальные стволовые клетки человека (BM-hMSCs), полученные из костного мозга, доставленные путем интракаротидной инъекции, успешно приживаются во внутричерепных глиомах у мышей19. Мы использовали эту модель для сравнения эффектов лигирования ОСА с восстановлением кровообращения после внутрисонного введения BM-hMSCs у мышей с глиомой. Обнаженным мышам-атимам имплантировали клетки глиомы U87 с последующим введением меченых GFP BM-hMSCs с последующим лигированием CCA или репарацией CCA с восстановленным кровообращением. Через 3 дня мышей умерщвляли, а мозг собирали, фиксировали, а также проводили иммуногистохимию для выявления GFP, а также подсчитывали GFP-положительные клетки (рис. 8A-D).
Общее хоуминг GFP-BM-hMSCs во внутричерепные глиомы оценивали по общему количеству GFP-положительных клеток в пределах границы опухоли на двух разных предметных стеклах (срезы >на расстоянии 75 мкм друг от друга) из одного и того же образца. Сравнение средних значений с помощью непарного t-критерия показало, что не было существенной разницы между средним значением, наблюдаемым между двумя процедурами (P = 0,6858) (рис. 8E). Диспергацию GFP-BM-hMSCs по всей опухоли оценивали путем подсчета GFP-положительных клеток по 10 мощным полям внутри опухоли. Увеличение числа клеток в мощных полях может указывать на изменения в дисперсии клеток по всей опухоли в результате вариаций в процедуре. Сравнение медианных значений с использованием критерия Вилкоксона показало, что не было существенной разницы между медианным количеством GFP-положительных клеток в мощных полях между группами лигирования CCA и репарации CCA (рис. 8F).
Рисунок 1: Подготовка операционного стола и мыши к операции. (А,Б) Хирургическое ложе (этикетки А. Виниловая лента, образующая кровать, Б. Хирургическая лента фиксаторов передних конечностей, В. Подушка, Г. Груз, Д. Анестезиологический конус для носа, Ф. Тупой крючок ретрактора, Ж. 1 см швов из 70% этанола, Н. Тонкие щипцы, I. Щипцы с угловым концом, J. Узкие ножницы, К. Стерильные ватные шарики). (К,Г) Позиционирование мыши. (Э,Ж) Место операции и дезинфекция места операции. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Разрез и обнажение структур в месте инъекции. (А) Разрез по срединной линии. (В,В) Ретракция правой слюнной железы. (D) Также виден мышечный треугольник, образованный трахеей/грудиноподъязычной мышцей, грудино-ключично-сосцевидной мышцей и двужелудочной мышцей, омоподъязычной мышцей. (E) Общая сонная артерия, обозначенная стрелкой. (F) Блуждающий нерв и общая сонная артерия, обозначенные стрелками. Сокращения: sh = трахея/грудиноподъязычная мышца; sm = грудино-ключично-сосцевидная мышца; dg = двужелудочная мышца; oh = подъязычная мышца; CCA = Общая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Подготовка ОСА к инъекции. (А) Щипцы с угловым наконечником, пропущенные под ОСА. (B) Шов был наполовину натянут под CCA с помощью щипцов с угловым наконечником. (C) Второй шов был натянут на полпути под CCA. (D) Зашитые завязанные в свободные узы вокруг CCA. Аббревиатура: CCA = Общая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Изоляция и подготовка наружной сонной артерии. (A) CCA, наружная сонная артерия и внутренняя сонная артерия. (B) Шов наполовину протянут под ECA. Сокращения: CCA Общая сонная артерия; ECA = наружная сонная артерия; ICA = внутренняя сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Подготовка иглы и шприца. (А) Инъекция прямой иглой, при этом шприц прилегает к телу мыши. (В) Инъекция с помощью изогнутой иглы, при этом рука опирается на операционный стол. (К,Г) Готовим изогнутую иглу. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: Интракаротидное введение. (A) Верхний шов ослаблен, нижний шов затягивается на CCA, игла размещается над нижним швом. (В) Игла вводится сразу за скосом, артерия запаивается вокруг иглы. (C) Верхний шов приподнимается, чтобы перевернуть артерию вверх и предотвратить обратный поток. (D) Верхний шов на ОСА затягивается. Аббревиатура: CCA = Общая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 7: Восстановление места инъекции и восстановление кровообращения. (A) Место инъекции обозначено стрелкой. (Б) Место инъекции закрывается хирургическим узлом, минимум четыре захода. (К,Г) Расшатывание верхних и нижних швов на ОСА после восстановления места инъекции; После ослабления швов кровотечение не наблюдается. (E) Швы снимаются после того, как будет установлено, что место инъекции достаточно восстановлено. Аббревиатура: CCA = Общая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 8: Интракаротидное введение GFP-BM-hMSCs и сравнение хоуминга с внутричерепными опухолями глиомы после лигирования CCA или восстановления CCA с восстановленным кровообращением. Срезы тканей мозга мышей с опухолями окрашивали первичными анти-GFP и вторичными антителами Alexa Fluor 488 для мечения GFP-BM-hMSC (зеленым цветом). Ядра окрашивали в цвет Hoechst 33342 (синий). Репрезентативные маломощные поля меченых секций, показывающие общее хоуминг на опухоль, и поля высокой мощности, показывающие GFP-положительное распределение клеток после репарации CCA (A,C) или лигирования CCA (B,D). (E) Общее наведение GFP-BM-hMSCs на опухоли оценивали по общему количеству GFP-положительных клеток в пределах границы опухоли на двух разных предметных стеклах, а средние сравнивали с помощью t-критерия. Существенной разницы в общем самонаведении между альтернативными методами не наблюдалось (P = 0,6858). (F) Диспергирование GFP-BM-hMSCs по всей опухоли оценивали путем подсчета GFP-положительных клеток по 10 мощным полям внутри опухоли. Сравнение медианных значений по критерию Вилкоксона не показывает существенной разницы между индивидуумами, независимо от процедуры (P = 0,1914, 0,5000, 0,1641, 0,9512, 0,8828, 0,2207). Сокращения: GFP = зеленый флуоресцентный белок; GFP-BM-hMSCs = меченые GFP мезенхимальные стволовые клетки костного мозга человека; CCA = Общая сонная артерия. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Инъекции внутрисонной артерии в последние годы все чаще используются для доставки терапевтических средств к опухолям головного мозга. Следовательно, важно создать мышиные модели, которые отражают инъекции внутрисонной артерии у человека в исследовательских целях. Ранее инъекции в интракаротидную артерию у мышей выполняли с последующей перевязкой артерии, что ограничивает количество инъекций в артерию11,12. Кроме того, окклюзия сонной артерии у мышей может привести к ишемии головного мозга у некоторых линий мышей, которые не имеют полного круга Виллиса13. Мы разработали метод восстановления инъецированной сонной артерии для преодоления ограничений предыдущих методов. Восстановление места инъекции приводит к восстановлению притока крови к инъецируемой артерии, снижению вероятности ишемии головного мозга и облегчению последующих инъекций в ту же внутреннюю сонную артерию.
Несколько шагов, которые имеют решающее значение для успеха, требуют осторожного обращения с хирургическими инструментами или тканями, которые включают: правильное введение иглы в просвет артерии во избежание кровотечения во время внутрисонной инъекции; тщательное рассечение соединительной ткани из места инъекции перед введением иглы; удаление всех комочков и пузырьков воздуха в шприце и игле перед инъекцией; и правильное закрытие места инъекции для предотвращения закрытия просвета артерии во время ремонта. Чтобы предотвратить кровотечение после введения иглы, убедитесь, что игла введена в артерию за скосом, чтобы образовалось уплотнение вокруг стержня иглы. Чтобы избежать разрыва задней стенки артерии, введите иглу под небольшим углом и слегка покачайте шприц и иглу назад, чтобы кончик иглы не касался задней стенки артерии. Если введенный раствор вытекает во время инъекции, это говорит о том, что игла была введена только в соединительную ткань, окружающую артерию; Тщательное рассечение избытка соединительной ткани в месте инъекции перед инъекцией предотвратит эту проблему.
Что касается выбора шовной нити и техники закрытия, если при первоначальной инъекции использовалась игла 33 G и было произведено чистое введение в артерию, для восстановления артерии достаточно одного простого шва со швом 9-0. Если для инъекции используется игла большего размера (30 г и т. д.) или при введении иглы происходит разрыв (например, когда игла смещена от центра или артерия движется из-за дыхания мыши), это приводит к образованию немного большего отверстия, которое необходимо заделать. Двух простых швов или восьмерки обычно достаточно, чтобы заделать этот тип большого отверстия. Выбор между этими двумя методами основан на предпочтениях хирурга в данной ситуации. Важно отметить, что методика ремонта не оценивалась в ситуациях, когда отверстие в месте инъекции значительно больше, чем в ситуации, упомянутой выше. Если разрыв в месте инъекции распространяется в боковом направлении (создавая более широкое отверстие, превышающее одну треть окружности артерии), восстановление с помощью этого метода может привести к сокращению артерии и повышенному риску тромбоза.
Если при снятии швов из восстановленного места инъекции возникает кровотечение, это может быть связано с растяжением восстановленного участка при возобновлении нормального кровообращения; Это можно исправить, аккуратно накрыв отремонтированное место инъекции стерильной ватой и слегка надавливая на нее в течение 30 с. В качестве альтернативы, если есть кровотечение из восстановленного места инъекции без видимого кровотока и проксимальная расширенная артерия, это указывает на то, что игла шва прошла через заднюю стенку артерии во время восстановления. В этом случае аккуратно вскрыть края места инъекции во время ремонта, пропустить иглу шва через артерию под небольшим углом и визуально подтвердить, что шов не прошел через заднюю стенку перед завязыванием шовного узла.
С учетом этих мер метод восстановления места инъекции является точным и воспроизводимым для всех когорт животных, независимо от генетического фона или возраста. По нашему опыту, вероятность успеха составила 100% при трех разных хирургах, выполняющих процедуру. Обладая достаточным опытом и тщательно следуя предоставленному протоколу, мы не предвидим никаких сложностей для других хирургов при выполнении этой процедуры. С практикой опытный хирург может завершить процедуру за 15-20 минут. Если эксперимент позволяет это сделать, время на одно животное также можно сократить, оставив верхние и нижние швы CCA нетронутыми, отказавшись от ремонта места инъекции. Однако, как отмечалось выше, специфические для штамма различия в анатомии сосудов головного мозга были задокументированы, и важно убедиться, что штамм мыши, использованный в процедуре, может выдержать это, прежде чем начинать эксперимент.
Поскольку это хирургическая процедура, необходимо учитывать восстановление мышей. Стрессоустойчивость и заживление ран являются важными факторами, которые будут варьироваться в зависимости от разных линий мышей. Кроме того, воспаление в месте операции и образование рубцовой ткани могут увеличить время восстановления после повторных операций. Мы успешно провели несколько инъекций с интервалом в 7 дней, но если необходимы более частые инъекции, их следует тщательно оценить на конкретных линиях мышей, которые будут использоваться. Сильное воздействие и нагрузка на ОСА (во время изоляции, наложения и снятия швов, а также инъекций) могут повредить и ослабить стенки артерий, что приведет к разрыву при повторных инъекциях. Важно свести к минимуму рассечение поддерживающей соединительной ткани вокруг ОСА и бифуркацию и воздерживаться от чрезмерного натяжения артерии.
Полученные нами результаты свидетельствуют о том, что в данной модели лигирование ОСА или репарация ОСА с восстановлением кровообращения после инъекции не различаются по общей частоте хоуминга или распределению вводимых BM-hMSC по внутричерепным опухолям. Хотя это может варьироваться у разных линий мышей, использование восстановления места инъекции дает преимущество в виде восстановления кровотока к инъецируемой артерии, что позволяет проводить последующие инъекции в ту же артерию и, что важно, напоминает инъекции внутрисонной артерии у пациентов. Выбор лигирования или восстановления инъецированной артерии основан на типе эксперимента и используемой мышиной модели. Если требуется повторная инъекция или если модель мыши не имеет полного Willis Circle, следует использовать восстановление места инъекции. Возможность повторного введения CCA в мышиные модели может облегчить дополнительные экспериментальные манипуляции. Например, для тестирования нескольких доз потенциального терапевтического препарата, вводимого с течением времени, восстановление инъецированной артерии имеет важное значение для выполнения последующих инъекций. Этот метод также может быть полезен в экспериментах, связанных с введением комбинаций терапевтических агентов, которые необходимо вводить в разное время. Повышенная гибкость инъекций в сонную артерию, обеспечиваемая восстановлением инъецируемой артерии, улучшает трансляционную полезность моделей опухолей головного мозга мышей.
Это исследование было поддержано грантами Национального института рака (R01CA115729, R01CA214749 и 1P50 CA127001) и щедрыми благотворительными взносами в Программу™ лунных выстрелов Онкологического центра им. М. Д. Андерсона Техасского университета, Фонд Броча по исследованию рака мозга, Фонд семьи Элиас по исследованию опухолей мозга, Фонд исследований рака Присциллы Хайли, Фонд исследований рака мозга семьи Бауман Curefest. Фонд Чуаньвэй Лу, Фонд исследований рака мозга «Сладкая семья», Мемориальный фонд исследования рака Айры Шнайдера, Фонд Джима и Пэм Харрис, Фонд Джина Пеннебейкера по исследованию рака мозга, Фонд Соренсона по исследованию опухолей мозга, Мемориальный фонд Брайана Маккаллоха, Фонд TLC от сердца и Фонд Мэри Харрис Паппас по исследованию глиобластомы. все в F.F.L.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
1 mL syringes (low dead space) | Air-tite Products Co. | A1 | |
26 G; 1/2" needle | Air-tite Products Co. | N2612 | |
33 G; 1/2" needle | JBP, Air-tite Products Co. | JBP3313B | |
3 cm Petri dish | Falcon, Fisher Scientific | 08-772A | |
3M durapore surgical tape | Fisher Scientific | 19-071-152 | |
6-0 suture thread | Fine Science Tools | 18020-60 | |
70% Ethanol | Fisher Scientific | 04-355-122 | |
9-0 microsurgical suture with needle | Fine Science Tools | 12052-09 | |
Analgesic for major surgery | |||
Artificial tears/ophthalmic ointment | Covetrus | 8897 | |
Bead Sterilizer | Fisher Scientific | 14-955-341 | |
Betadine/Chlorhexidine | McKesson, Fisher Scientific | NC1696484 | |
Blunt hook retractor | Fine Science Tools | 17022-13 | |
Dissecting microscope | Zeiss Microscopy, LLC | 491903-0010-000 | |
Electric heating pad | Insource, Fisher Scientific | NC0667724 | |
Extra narrow scissors | Fine Science Tools | 14088-10 | |
Fine forceps - Dumont #5 forceps with micro-blunted tips | Fine Science Tools | 11253-20 | |
Fine forceps - Dumont #5/45 angled tip forceps with micro-blunted tips | Fine Science Tools | 11253-25 | |
Isoflurane vaporizer (or Ketamine/Xylazine cocktail) | Kent Scientific | VetFlo-1231 | |
Light source | Laxco, Fisher Scientific | AMPSILED21 | |
Mouse anesthesia nose cone | Braintree Scientific, Inc | XENO- M | |
Needle driver | Fine Science Tools | 12002-12 | |
Sterile cotton swabs | Texwipe, Fisher Scientific | 18-366-472 | |
Sterile gauze pads | Covidien, Fisher Scientific | 22-037-907 | |
Sterile saline (0.9%) | KD Medical, Fisher Scientific | 50-103-1363 | |
Sterile surgical drapes | Fisher Scientific | 50-129-6666 | |
Sterile surgical/downdraft table | |||
Sterile suture pack (any suitable diameter for mouse wound closure) | Ethicon, Fisher Scientific | 50-209-2811 | |
Surgical tools | |||
Vinyl lab tape | Fisher Scientific | 15-901 |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved