Microscopia intravitale a due fotoni del glioblastoma in un modello murino

Summary

Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Abstract

La somministrazione di terapie antitumorali somministrate per via endovenosa ai tumori cerebrali è limitata dalla barriera emato-encefalica. Un metodo per visualizzare direttamente l'accumulo e la distribuzione di macromolecole nei tumori cerebrali in vivo migliorerebbe notevolmente la nostra capacità di comprendere e ottimizzare la somministrazione di farmaci nei modelli preclinici. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio in vivo in tempo reale di nanoparticelle marcate con fluorescenza somministrate per via endovenosa con microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) in un modello murino di glioblastoma (GBM).

Il protocollo contiene una descrizione in più fasi della procedura, tra cui l'anestesia e l'analgesia degli animali da esperimento, la creazione di una finestra cranica, l'impianto di cellule GBM, il posizionamento di una barra per la testa, la conduzione di studi 2P-IVM e l'assistenza post-chirurgica per studi di follow-up a lungo termine. Mostriamo sessioni rappresentative di imaging 2P-IVM e analisi delle immagini, esaminiamo i vantaggi e gli svantaggi di questa tecnologia e discutiamo le potenziali applicazioni.

Questo metodo può essere facilmente modificato e adattato per diverse domande di ricerca nel campo dell'imaging cerebrale preclinico in vivo .

Introduction

La microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) è una tecnica di imaging a fluorescenza che consente la visualizzazione di tessuti viventi¹.

Sviluppato per la prima volta negli anni '90, 2P-IVM è stato utilizzato per l'analisi in vivo della retina², del rene³, dell'intestino tenue⁴, della coclea⁵, del cuore⁶, della trachea^{7 e del} cervello in vari modelli preclinici ^8,9. Nel campo delle neuroscienz....

Protocol

La procedura per gli animali descritta nel presente protocollo è conforme ai requisiti del gruppo di esperti scientifici sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC).

1. Colture cellulari

1. Preparazione della cappa
   1. Lavarsi le mani, indossare guanti e camice da laboratorio. Accendere l'armadio di sicurezza biologica e impostare la livella dell'anta a un'altezza di apertura adeguata. Lasciare spurgare la cappa per 3-5 minuti. Spruzzare l'area del cappuccio con.......

Discussion

Presentiamo un metodo per il monitoraggio in tempo reale delle NP in vivo utilizzando 2P-IVM attraverso una finestra cranica per valutare la somministrazione tumorale di NP di ossido di ferro marcate con fluorescenza. La tecnica chirurgica per questa procedura richiede una mano ferma e abilità chirurgiche sperimentali avanzate. Si consiglia di esercitarsi nell'uso di carcasse o fantasmi prima di passare all'esperienza animale dal vivo. In alternativa, Hoeferlin et al. hanno implementato un trapano robotico per .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.9% sodium chloride infusion solution	Baxter Corp	533-JB1301P
Dulbecco's Modified Eagle Medium	Invitrogen	11965-092
1 mL syringes	BD	Luer-Lok syringe, REF309628
10% FBS	Thermo fisher	Cytiva SH30910.03HI
10% DMSO	Sigma-Aldrich	D8418-50ML
2-photon microscope	Prairie Technologies, Bruker	Prairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%	Medline Industries, LP	MDS093810
Alcohol, spray bottle	Decon Labs Inc	Decon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foil	Reynold Brands	Reynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machine	Patterson Scientific	SAS3
Anesthesia monitoring	Kent Scientific	MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid	Invitrogen	15240-096
Betadine applicators	Professional Disposables International, Inc	S41125
Biopsy punch, 5 mm	Miltex	Size 5
Buprenorphine sustained release	Zoo Pharm	Bup SR Lab, 1.0 mg/mL	A generic drug can be used instead.
C6 rat glioma cell line	ATCC (American Tissue Culture Collection)	CCL-107
Cannulas	BD	16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
Carprofen	Pfizer	Rimadyl, 50 mg/ml	A generic drug can be used instead.
Cefazoline	Sagent Pharmaceuticals	25021-101-10, 1 g/vial	A generic drug can be used instead.
Cell strainer, 40 µm	Fisher Scientific	87711
Cotton tip applicators, 6”	Dyad Medical Sourcing, LLC	HCS1005
Dental cement	Stoelting Co	51459	Dental cement kit, clear, 2 components
Dexamethasone	Bimeda	138RX, 2 mg/mL	A generic drug can be used instead.
DietGel	ClearH2O	Recovery, 72-06-502
Drape	Cardinal Health	Bio Shield Wrap
Drill	Saeyang Microtech	Escort Pro, B08350
Drill tips	Hager & Meissinger GmbH	REF310104001001005	Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis software	National Institute of Health	https://imagej.net/software/fiji/
Forceps	Fisher Scientific	13-812-41
Gauze	Fisher HealthCare	Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam	Ethicon Inc.	Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator	Cellpoint Scientific	Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameter	Fisher Scientific	Menzel Cover glass
Gloves, non-sterile	Fisher Scientific	Nitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterile	Medline Industries, LP	MDS104070
Hair removal cream	Church & Dwight	Nair Hair remover lotion
Hamilton syringe	Hamilton Company Inc	Gastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, Mg	Fisher Scientific	PI88284
Head bar	Hongway	5 mm inner diameter O-rings
Heating pad	Stoelting Co.	Rodent warmer X2
Insulin syringes	Exel International Medical Products	29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticles	Covis Pharma GmbH	Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
Isoflurane	Dechra	26675-46-7
Mice	Jackson Laboratories	NSG, Strain 005557
Microscope (surgery)	Seiler Medical	Seiler IQ Q-100-220
Nanoparticles	Custom		Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointment	Major pharmaceuticals	Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
Oxygen	Linde Gas & Equipment Inc.	High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cups	Georgia-Pacirif Consumer Products	Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubing	Braintree Scientific	50-195-5494
Scale	Ohaus Corp	CR2200
Scalpel	Integra Life Sciences Production Corp	Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel
Scissors	Fisher Scientific	13-804-18
Sealant	Henkel Corp	Loctite 4014
Single use lab gown	High Tech Conversions	17-444-081
Stereotactic frame	Stoelting Co.	Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems	Fisher Scientific	S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam box	N/A	N/A
Surgical gloves	Cardinal Health	19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive	3M Animal Care Prodcuts	1469SB
Tail vein cathether	Custom		Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing
TrypLE Express (1x), no phenol red	Invitrogen	12604-039
Ultraviolett torch	Spring sunshine technology	Consciot