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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.

Abstract

La somministrazione di terapie antitumorali somministrate per via endovenosa ai tumori cerebrali è limitata dalla barriera emato-encefalica. Un metodo per visualizzare direttamente l'accumulo e la distribuzione di macromolecole nei tumori cerebrali in vivo migliorerebbe notevolmente la nostra capacità di comprendere e ottimizzare la somministrazione di farmaci nei modelli preclinici. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio in vivo in tempo reale di nanoparticelle marcate con fluorescenza somministrate per via endovenosa con microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) in un modello murino di glioblastoma (GBM).

Il protocollo contiene una descrizione in più fasi della procedura, tra cui l'anestesia e l'analgesia degli animali da esperimento, la creazione di una finestra cranica, l'impianto di cellule GBM, il posizionamento di una barra per la testa, la conduzione di studi 2P-IVM e l'assistenza post-chirurgica per studi di follow-up a lungo termine. Mostriamo sessioni rappresentative di imaging 2P-IVM e analisi delle immagini, esaminiamo i vantaggi e gli svantaggi di questa tecnologia e discutiamo le potenziali applicazioni.

Questo metodo può essere facilmente modificato e adattato per diverse domande di ricerca nel campo dell'imaging cerebrale preclinico in vivo .

Introduction

La microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) è una tecnica di imaging a fluorescenza che consente la visualizzazione di tessuti viventi1.

Sviluppato per la prima volta negli anni '90, 2P-IVM è stato utilizzato per l'analisi in vivo della retina2, del rene3, dell'intestino tenue4, della coclea5, del cuore6, della trachea7 e del cervello in vari modelli preclinici 8,9. Nel campo delle neuroscienz....

Protocol

La procedura per gli animali descritta nel presente protocollo è conforme ai requisiti del gruppo di esperti scientifici sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC).

1. Colture cellulari

  1. Preparazione della cappa
    1. Lavarsi le mani, indossare guanti e camice da laboratorio. Accendere l'armadio di sicurezza biologica e impostare la livella dell'anta a un'altezza di apertura adeguata. Lasciare spurgare la cappa per 3-5 minuti. Spruzzare l'area del cappuccio con.......

Representative Results

Qui, abbiamo eseguito un intervento chirurgico alla finestra cranica e innestato cellule C6 in un modello murino NSG di GBM (n = 5). Una tenuta adeguata tra tutti i componenti coinvolti nella creazione della finestra (Figura 1A) garantirà la durata delle finestre per l'imaging a lungo termine e, inoltre, ridurrà la morbilità. Utilizzando lo stadio adattato per la 2P-IVM in vivo (Figura 2), abbiamo potuto visualizzare gli animali sotto anestesia per u.......

Discussion

Presentiamo un metodo per il monitoraggio in tempo reale delle NP in vivo utilizzando 2P-IVM attraverso una finestra cranica per valutare la somministrazione tumorale di NP di ossido di ferro marcate con fluorescenza. La tecnica chirurgica per questa procedura richiede una mano ferma e abilità chirurgiche sperimentali avanzate. Si consiglia di esercitarsi nell'uso di carcasse o fantasmi prima di passare all'esperienza animale dal vivo. In alternativa, Hoeferlin et al. hanno implementato un trapano robotico per .......

Acknowledgements

Vorremmo ringraziare il servizio di microscopia neuroscientifica di Stanford Wu Tsai, il centro di Stanford per le innovazioni nell'imaging in vivo (SCi3) - centro di imaging per piccoli animali, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) e Stanford Preclinical Imaging Facility a Porter Drive per aver fornito l'attrezzatura e l'infrastruttura per questo progetto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Istituto Nazionale per la Salute del Bambino e lo Sviluppo Umano, numero di sovvenzione R01HD103638. Ringraziamo lo Schnitzer Group, l'Università di Stanford; il laboratorio Zuo, Università di Santa Cruz; e il Neurov....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.9% sodium chloride infusion solutionBaxter Corp533-JB1301P

Dulbecco's Modified Eagle Medium
Invitrogen11965-092
1 mL syringesBDLuer-Lok syringe, REF309628
10% FBSThermo fisherCytiva SH30910.03HI
10% DMSOSigma-AldrichD8418-50ML
2-photon microscopePrairie Technologies, BrukerPrairie Ultima IV
Alcohol applicators, 70%Medline Industries, LPMDS093810
Alcohol, spray bottleDecon Labs IncDecon SaniHol, 04-355-122
Aluminum foilReynold BrandsReynold Wrap non-stick aluminum foil
Anesthesia machinePatterson ScientificSAS3
Anesthesia monitoring Kent Scientific MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquidInvitrogen15240-096
Betadine applicatorsProfessional Disposables International, IncS41125
Biopsy punch, 5 mm MiltexSize 5
Buprenorphine sustained releaseZoo PharmBup SR Lab, 1.0 mg/mLA generic drug can be used instead. 
C6 rat glioma cell lineATCC (American Tissue Culture Collection)CCL-107
CannulasBD16 G, 1.1/2”, 30 G, 1”
CarprofenPfizer Rimadyl, 50 mg/mlA generic drug can be used instead. 
CefazolineSagent Pharmaceuticals25021-101-10, 1 g/vialA generic drug can be used instead. 
Cell strainer, 40 µmFisher Scientific87711
Cotton tip applicators, 6” Dyad Medical Sourcing, LLCHCS1005
Dental cementStoelting Co51459Dental cement kit, clear, 2 components
DexamethasoneBimeda138RX, 2 mg/mLA generic drug can be used instead. 
DietGelClearH2ORecovery, 72-06-502
Drape Cardinal HealthBio Shield Wrap
DrillSaeyang MicrotechEscort Pro, B08350
Drill tips Hager & Meissinger GmbHREF310104001001005Size 005, US 1/4
FIJI imaging analysis softwareNational Institute of Healthhttps://imagej.net/software/fiji/
ForcepsFisher Scientific13-812-41
GauzeFisher HealthCareSterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469
Gelfoam Ethicon Inc. Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972
Germinator Cellpoint Scientific Germinator 500, No. 11688
Glass coverslips, 5 mm diameterFisher ScientificMenzel Cover glass 
Gloves, non-sterileFisher ScientificNitrile powder-free medical examination gloves
Gloves, sterileMedline Industries, LPMDS104070
Hair removal creamChurch & DwightNair Hair remover lotion 
Hamilton syringeHamilton Company IncGastight #1701, 10 µL
HBSS without Ca, MgFisher ScientificPI88284
Head barHongway5 mm inner diameter O-rings
Heating padStoelting Co. Rodent warmer X2
Insulin syringesExel International Medical Products 29G x 1/2″
Iron oxide nanoparticlesCovis Pharma GmbHFeraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501
IsofluraneDechra26675-46-7
MiceJackson LaboratoriesNSG, Strain 005557
Microscope (surgery)Seiler MedicalSeiler IQ Q-100-220
NanoparticlesCustomIron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate
Ophtalmic ointmentMajor pharmaceuticalsLubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964
OxygenLinde Gas & Equipment Inc. High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540
Plastic cupsGeorgia-Pacirif Consumer ProductsDixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400
Polyethylene tubingBraintree Scientific50-195-5494
ScaleOhaus CorpCR2200
ScalpelIntegra Life Sciences Production CorpIntegra Miltex Stainless steel disposable scalpel
ScissorsFisher Scientific13-804-18
SealantHenkel CorpLoctite 4014
Single use lab gownHigh Tech Conversions17-444-081
Stereotactic frameStoelting Co. Stoelting New Standard TM
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration SystemsFisher ScientificS2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE
Styrofoam boxN/AN/A
Surgical glovesCardinal Health19-163-108
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive3M Animal Care Prodcuts1469SB
Tail vein cathetherCustomConsists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing 
TrypLE Express (1x), no phenol redInvitrogen12604-039
Ultraviolett torchSpring sunshine technologyConsciot

References

  1. Denk, W., Strickler, J. H., Webb, W. W. Two-photon laser scanning fluorescence microscopy. Science. 248 (4951), 73-76 (1990).
  2. Wang, Z., McCracken, S., Williams, P. R. Transpupillary two-photon in vivo imaging of the mouse retina.

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