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* These authors contributed equally
Presentiamo un nuovo approccio per la microscopia a due fotoni della somministrazione tumorale di nanoparticelle di ossido di ferro marcate con fluorescenza al glioblastoma in un modello murino.
La somministrazione di terapie antitumorali somministrate per via endovenosa ai tumori cerebrali è limitata dalla barriera emato-encefalica. Un metodo per visualizzare direttamente l'accumulo e la distribuzione di macromolecole nei tumori cerebrali in vivo migliorerebbe notevolmente la nostra capacità di comprendere e ottimizzare la somministrazione di farmaci nei modelli preclinici. Questo protocollo descrive un metodo per il monitoraggio in vivo in tempo reale di nanoparticelle marcate con fluorescenza somministrate per via endovenosa con microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) in un modello murino di glioblastoma (GBM).
Il protocollo contiene una descrizione in più fasi della procedura, tra cui l'anestesia e l'analgesia degli animali da esperimento, la creazione di una finestra cranica, l'impianto di cellule GBM, il posizionamento di una barra per la testa, la conduzione di studi 2P-IVM e l'assistenza post-chirurgica per studi di follow-up a lungo termine. Mostriamo sessioni rappresentative di imaging 2P-IVM e analisi delle immagini, esaminiamo i vantaggi e gli svantaggi di questa tecnologia e discutiamo le potenziali applicazioni.
Questo metodo può essere facilmente modificato e adattato per diverse domande di ricerca nel campo dell'imaging cerebrale preclinico in vivo .
La microscopia intravitale a due fotoni (2P-IVM) è una tecnica di imaging a fluorescenza che consente la visualizzazione di tessuti viventi1.
Sviluppato per la prima volta negli anni '90, 2P-IVM è stato utilizzato per l'analisi in vivo della retina2, del rene3, dell'intestino tenue4, della coclea5, del cuore6, della trachea7 e del cervello in vari modelli preclinici 8,9. Nel campo delle neuroscienz....
La procedura per gli animali descritta nel presente protocollo è conforme ai requisiti del gruppo di esperti scientifici sulla cura degli animali da laboratorio (APLAC).
1. Colture cellulari
Qui, abbiamo eseguito un intervento chirurgico alla finestra cranica e innestato cellule C6 in un modello murino NSG di GBM (n = 5). Una tenuta adeguata tra tutti i componenti coinvolti nella creazione della finestra (Figura 1A) garantirà la durata delle finestre per l'imaging a lungo termine e, inoltre, ridurrà la morbilità. Utilizzando lo stadio adattato per la 2P-IVM in vivo (Figura 2), abbiamo potuto visualizzare gli animali sotto anestesia per u.......
Presentiamo un metodo per il monitoraggio in tempo reale delle NP in vivo utilizzando 2P-IVM attraverso una finestra cranica per valutare la somministrazione tumorale di NP di ossido di ferro marcate con fluorescenza. La tecnica chirurgica per questa procedura richiede una mano ferma e abilità chirurgiche sperimentali avanzate. Si consiglia di esercitarsi nell'uso di carcasse o fantasmi prima di passare all'esperienza animale dal vivo. In alternativa, Hoeferlin et al. hanno implementato un trapano robotico per .......
Gli autori dichiarano di non avere alcun conflitto di interessi.
Vorremmo ringraziare il servizio di microscopia neuroscientifica di Stanford Wu Tsai, il centro di Stanford per le innovazioni nell'imaging in vivo (SCi3) - centro di imaging per piccoli animali, NIH S10 Shared Instrumentation Grant (S10RR026917-01, PI Michael Moseley, Ph.D.) e Stanford Preclinical Imaging Facility a Porter Drive per aver fornito l'attrezzatura e l'infrastruttura per questo progetto. Questo lavoro è stato sostenuto da una sovvenzione dell'Istituto Nazionale per la Salute del Bambino e lo Sviluppo Umano, numero di sovvenzione R01HD103638. Ringraziamo lo Schnitzer Group, l'Università di Stanford; il laboratorio Zuo, Università di Santa Cruz; e il Neurov....
Name | Company | Catalog Number | Comments |
0.9% sodium chloride infusion solution | Baxter Corp | 533-JB1301P | |
Dulbecco's Modified Eagle Medium | Invitrogen | 11965-092 | |
1 mL syringes | BD | Luer-Lok syringe, REF309628 | |
10% FBS | Thermo fisher | Cytiva SH30910.03HI | |
10% DMSO | Sigma-Aldrich | D8418-50ML | |
2-photon microscope | Prairie Technologies, Bruker | Prairie Ultima IV | |
Alcohol applicators, 70% | Medline Industries, LP | MDS093810 | |
Alcohol, spray bottle | Decon Labs Inc | Decon SaniHol, 04-355-122 | |
Aluminum foil | Reynold Brands | Reynold Wrap non-stick aluminum foil | |
Anesthesia machine | Patterson Scientific | SAS3 | |
Anesthesia monitoring | Kent Scientific | MouseSTAT Jr. Rodent Pulsoxymeter | |
Antibiotic-Antimycotic (100x), liquid | Invitrogen | 15240-096 | |
Betadine applicators | Professional Disposables International, Inc | S41125 | |
Biopsy punch, 5 mm | Miltex | Size 5 | |
Buprenorphine sustained release | Zoo Pharm | Bup SR Lab, 1.0 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
C6 rat glioma cell line | ATCC (American Tissue Culture Collection) | CCL-107 | |
Cannulas | BD | 16 G, 1.1/2”, 30 G, 1” | |
Carprofen | Pfizer | Rimadyl, 50 mg/ml | A generic drug can be used instead. |
Cefazoline | Sagent Pharmaceuticals | 25021-101-10, 1 g/vial | A generic drug can be used instead. |
Cell strainer, 40 µm | Fisher Scientific | 87711 | |
Cotton tip applicators, 6” | Dyad Medical Sourcing, LLC | HCS1005 | |
Dental cement | Stoelting Co | 51459 | Dental cement kit, clear, 2 components |
Dexamethasone | Bimeda | 138RX, 2 mg/mL | A generic drug can be used instead. |
DietGel | ClearH2O | Recovery, 72-06-502 | |
Drape | Cardinal Health | Bio Shield Wrap | |
Drill | Saeyang Microtech | Escort Pro, B08350 | |
Drill tips | Hager & Meissinger GmbH | REF310104001001005 | Size 005, US 1/4 |
FIJI imaging analysis software | National Institute of Health | https://imagej.net/software/fiji/ | |
Forceps | Fisher Scientific | 13-812-41 | |
Gauze | Fisher HealthCare | Sterile Cotton Gauze Pad, 4 x 4”, 22-415-469 | |
Gelfoam | Ethicon Inc. | Surgifoam absorbable gelatin sponge, Ref. 1972 | |
Germinator | Cellpoint Scientific | Germinator 500, No. 11688 | |
Glass coverslips, 5 mm diameter | Fisher Scientific | Menzel Cover glass | |
Gloves, non-sterile | Fisher Scientific | Nitrile powder-free medical examination gloves | |
Gloves, sterile | Medline Industries, LP | MDS104070 | |
Hair removal cream | Church & Dwight | Nair Hair remover lotion | |
Hamilton syringe | Hamilton Company Inc | Gastight #1701, 10 µL | |
HBSS without Ca, Mg | Fisher Scientific | PI88284 | |
Head bar | Hongway | 5 mm inner diameter O-rings | |
Heating pad | Stoelting Co. | Rodent warmer X2 | |
Insulin syringes | Exel International Medical Products | 29G x 1/2″ | |
Iron oxide nanoparticles | Covis Pharma GmbH | Feraheme ferumoxytol injection, 510 mg/17 mL, 59338077501 | |
Isoflurane | Dechra | 26675-46-7 | |
Mice | Jackson Laboratories | NSG, Strain 005557 | |
Microscope (surgery) | Seiler Medical | Seiler IQ Q-100-220 | |
Nanoparticles | Custom | Iron oxide nanoparticles (Ferumoxytol) labeled with fluorescein isothiocyanate | |
Ophtalmic ointment | Major pharmaceuticals | Lubrifresh P.M. nighttime ointment, 203964 | |
Oxygen | Linde Gas & Equipment Inc. | High Pressure Steel K Style Cylinder, 249CF, 2000PSIG, CGA 540 | |
Plastic cups | Georgia-Pacirif Consumer Products | Dixie Portion Cup, 2 oz., Plastic, Clear, PK2400 | |
Polyethylene tubing | Braintree Scientific | 50-195-5494 | |
Scale | Ohaus Corp | CR2200 | |
Scalpel | Integra Life Sciences Production Corp | Integra Miltex Stainless steel disposable scalpel | |
Scissors | Fisher Scientific | 13-804-18 | |
Sealant | Henkel Corp | Loctite 4014 | |
Single use lab gown | High Tech Conversions | 17-444-081 | |
Stereotactic frame | Stoelting Co. | Stoelting New Standard TM | |
Sterile Vacuum Bottle Top Filtration Systems | Fisher Scientific | S2GPU05RE, MilliporeSigma NO.:S2GPU05RE | |
Styrofoam box | N/A | N/A | |
Surgical gloves | Cardinal Health | 19-163-108 | |
Surgical glue, 3M Vetbond tissues adhesive | 3M Animal Care Prodcuts | 1469SB | |
Tail vein cathether | Custom | Consists of two 30 G cannulas connected with sillicone tubing | |
TrypLE Express (1x), no phenol red | Invitrogen | 12604-039 | |
Ultraviolett torch | Spring sunshine technology | Consciot |
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