מידול ליגנדות למפות הנגזרות מקריומיקרוסקופ אלקטרונים

Summary

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

Abstract

פענוח יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנד בקומפלקס מקרומולקולרי חיוני להבנת המנגנון המולקולרי, התהליכים הביולוגיים העומדים בבסיסו ופיתוח תרופות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ אלקטרונים בדגימה קריוגנית (cryoEM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לקביעת מבנים של מקרומולקולות ולחקור את אופן קשירת הליגנד ברזולוציה כמעט אטומית. זיהוי ומידול מולקולות שאינן חלבונים במפות cryoEM הוא לעתים קרובות מאתגר בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המולקולה המעניינת והרעש המובנה בנתונים. במאמר זה, הקוראים נחשפים לתוכנות ושיטות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדים, בניית מודלים ושכלול קואורדינטות אטומיות באמצעות מקרומולקולות נבחרות. אחת הדרכים הפשוטות ביותר לזהות נוכחות של ליגנד, כפי שמודגם עם אנזים האנולז, היא להחסיר את שתי המפות המתקבלות עם ובלי הליגנד. הצפיפות הנוספת של הליגנד עשויה לבלוט במפת ההפרשים גם בסף גבוה יותר. ישנם מקרים, כפי שמוצג במקרה של קולטן גלוטמט מטבולי mGlu₅, כאשר מפות הבדל פשוטות כאלה לא ניתן ליצור. השיטה שהוצגה לאחרונה לגזירת מפת ההשמטה Fo-Fc יכולה לשמש ככלי לאימות והדגמת נוכחות הליגנד. לבסוף, תוך שימוש בגלקטוזידאז β שנחקר היטב כדוגמה, מנותחת השפעת הרזולוציה על מידול הליגנדות ומולקולות הממס במפות cryoEM, ומוצגת השקפה על האופן שבו ניתן להשתמש ב- cryoEM בגילוי תרופות.

Introduction

תאים משיגים את תפקידיהם על ידי ביצוע אינספור תגובות כימיות בו זמנית ובאופן עצמאי, כל אחת מווסתת בקפידה כדי להבטיח את הישרדותם ואת יכולת ההסתגלות שלהם בתגובה לרמזים סביבתיים. זה מושג על ידי זיהוי מולקולרי, המאפשר ביומולקולות, במיוחד חלבונים, ליצור קומפלקסים חולפים או יציבים עם מקרומולקולות אחרות, כמו גם מולקולות קטנות או ליגנדות¹. לפיכך, אינטראקציות חלבון-ליגנד הן בסיסיות לכל התהליכים בביולוגיה, הכוללים את ויסות ביטוי ופעילות החלבון, זיהוי מצעים וקו-פקטורים על ידי אנזימים, כמו גם כיצד תאים תופסים ומעבירים אותות ^1,2. הבנה טובה יותר של התכונות הקינטיות, התרמודינמיות והמבניות של קומפלקס החל....

Protocol

1. מידול phosphoenolpyruvate (PEP) ב enolase מ Mycobacterium tuberculosis

1. זיהוי צפיפות ליגנד במפת cryoEM של קומפלקס PEP-enolase
   1. הורד את חצאי המפות הלא מחודדות (emd_30988_additional_1.map ו- emd_30988_additional_2.map) של apo-enolase מהנתונים הנוספים ב- EMDB (ראה טבלת חומרים).
   2. פתח את ChimeraX (ראה טבלת חומרים). פתח את ח?.......

Discussion

השיפורים בחומרה ובתוכנה של המיקרוסקופ הביאו לעלייה במספר מבני ה-cryoEM בשנים האחרונות. למרות שהרזולוציה הגבוהה ביותר שהושגה כרגע ב- cryoEM של חלקיק יחיד היא 1.2 Å 57,58,59, רוב המבנים נקבעים סביב רזולוציית 3-4 Å. מידול ליגנדות במפות ברזולוציה בינונית .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more