A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.
פענוח יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנד בקומפלקס מקרומולקולרי חיוני להבנת המנגנון המולקולרי, התהליכים הביולוגיים העומדים בבסיסו ופיתוח תרופות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ אלקטרונים בדגימה קריוגנית (cryoEM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לקביעת מבנים של מקרומולקולות ולחקור את אופן קשירת הליגנד ברזולוציה כמעט אטומית. זיהוי ומידול מולקולות שאינן חלבונים במפות cryoEM הוא לעתים קרובות מאתגר בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המולקולה המעניינת והרעש המובנה בנתונים. במאמר זה, הקוראים נחשפים לתוכנות ושיטות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדים, בניית מודלים ושכלול קואורדינטות אטומיות באמצעות מקרומולקולות נבחרות. אחת הדרכים הפשוטות ביותר לזהות נוכחות של ליגנד, כפי שמודגם עם אנזים האנולז, היא להחסיר את שתי המפות המתקבלות עם ובלי הליגנד. הצפיפות הנוספת של הליגנד עשויה לבלוט במפת ההפרשים גם בסף גבוה יותר. ישנם מקרים, כפי שמוצג במקרה של קולטן גלוטמט מטבולי mGlu5, כאשר מפות הבדל פשוטות כאלה לא ניתן ליצור. השיטה שהוצגה לאחרונה לגזירת מפת ההשמטה Fo-Fc יכולה לשמש ככלי לאימות והדגמת נוכחות הליגנד. לבסוף, תוך שימוש בגלקטוזידאז β שנחקר היטב כדוגמה, מנותחת השפעת הרזולוציה על מידול הליגנדות ומולקולות הממס במפות cryoEM, ומוצגת השקפה על האופן שבו ניתן להשתמש ב- cryoEM בגילוי תרופות.
תאים משיגים את תפקידיהם על ידי ביצוע אינספור תגובות כימיות בו זמנית ובאופן עצמאי, כל אחת מווסתת בקפידה כדי להבטיח את הישרדותם ואת יכולת ההסתגלות שלהם בתגובה לרמזים סביבתיים. זה מושג על ידי זיהוי מולקולרי, המאפשר ביומולקולות, במיוחד חלבונים, ליצור קומפלקסים חולפים או יציבים עם מקרומולקולות אחרות, כמו גם מולקולות קטנות או ליגנדות1. לפיכך, אינטראקציות חלבון-ליגנד הן בסיסיות לכל התהליכים בביולוגיה, הכוללים את ויסות ביטוי ופעילות החלבון, זיהוי מצעים וקו-פקטורים על ידי אנזימים, כמו גם כיצד תאים תופסים ומעבירים אותות 1,2. הבנה טובה יותר של התכונות הקינטיות, התרמודינמיות והמבניות של קומפלקס החל....
1. מידול phosphoenolpyruvate (PEP) ב enolase מ Mycobacterium tuberculosis
דוגמה 1
האנזים אנולאז משחפת מזרז את השלב הלפני אחרון של גליקוליזה וממיר 2-פוספוגליצראט לפוספונולפירובט (PEP), שהוא מתווך חיוני למספר מסלולים מטבוליים44,45. נתוני CryoEM עבור דגימות apo-enolase ו-PEP enolase נאספו באותו גודל פיקסלים של 1.07 Å, ועיבוד התמונה בוצע ?.......
השיפורים בחומרה ובתוכנה של המיקרוסקופ הביאו לעלייה במספר מבני ה-cryoEM בשנים האחרונות. למרות שהרזולוציה הגבוהה ביותר שהושגה כרגע ב- cryoEM של חלקיק יחיד היא 1.2 Å 57,58,59, רוב המבנים נקבעים סביב רזולוציית 3-4 Å. מידול ליגנדות במפות ברזולוציה בינונית .......
ש"י הוא מקבל את מלגת הדוקטורט מ- DAE-TIFR, והמימון מוכר. KRV מכירה במענק DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 ובתמיכת המחלקה לאנרגיה אטומית, ממשלת הודו, תחת פרויקט זיהוי מס'. RTI4006.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
CCP4-8.0 | Consortium of several institutes | https://www.ccp4.ac.uk | Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography |
CCP-EM | Consortium of several institutes | https://www.ccpem.ac.uk/download.php | Free for academic users and includes Coot, Relion and many others |
Coot | Paul Emsley, LMB, Cambridge | https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/ | General software for model building but also available with other suites described above |
DockinMap (Phenix) | Consortium of several institutes | https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html | Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps |
Electron Microscopy Data Bank | Consortium of several institutes | https://www.ebi.ac.uk/emdb/ | Public Repository for Electron Microscopy maps |
Falcon | Thermo Fisher Scientific | https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf | Commercial, camera from Thermo Fisher |
Phenix | Consortium of several institutes | https://phenix-online.org/download | Free for academic users and includes Coot |
Protein Data Bank | Consortium of several institutes | https://rcsb.org | Public database of macromolecular structures |
Pymol | Schrodinger | https://pymol.org/2/ | Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee. |
Relion | MRC-LMB, Cambridge | https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html | Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM |
Titan Krios | Thermo Fisher Scientific | https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE | Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher |
UCSF Chimera | UCSF, USA | https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html | General purpose software for display, analysis and more |
UCSF Chimera X | UCSF, USA | https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/ | General purpose software for display, analysis and more |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved