Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

פרוטוקול זה מציג את הכלים הזמינים למידול ליגנדות של מולקולות קטנות במפות cryoEM של מקרומולקולות.

Abstract

פענוח יחסי הגומלין בין חלבונים לליגנד בקומפלקס מקרומולקולרי חיוני להבנת המנגנון המולקולרי, התהליכים הביולוגיים העומדים בבסיסו ופיתוח תרופות. בשנים האחרונות, מיקרוסקופ אלקטרונים בדגימה קריוגנית (cryoEM) התגלה כטכניקה רבת עוצמה לקביעת מבנים של מקרומולקולות ולחקור את אופן קשירת הליגנד ברזולוציה כמעט אטומית. זיהוי ומידול מולקולות שאינן חלבונים במפות cryoEM הוא לעתים קרובות מאתגר בשל הרזולוציה האנאיזוטרופית על פני המולקולה המעניינת והרעש המובנה בנתונים. במאמר זה, הקוראים נחשפים לתוכנות ושיטות שונות המשמשות כיום לזיהוי ליגנדים, בניית מודלים ושכלול קואורדינטות אטומיות באמצעות מקרומולקולות נבחרות. אחת הדרכים הפשוטות ביותר לזהות נוכחות של ליגנד, כפי שמודגם עם אנזים האנולז, היא להחסיר את שתי המפות המתקבלות עם ובלי הליגנד. הצפיפות הנוספת של הליגנד עשויה לבלוט במפת ההפרשים גם בסף גבוה יותר. ישנם מקרים, כפי שמוצג במקרה של קולטן גלוטמט מטבולי mGlu5, כאשר מפות הבדל פשוטות כאלה לא ניתן ליצור. השיטה שהוצגה לאחרונה לגזירת מפת ההשמטה Fo-Fc יכולה לשמש ככלי לאימות והדגמת נוכחות הליגנד. לבסוף, תוך שימוש בגלקטוזידאז β שנחקר היטב כדוגמה, מנותחת השפעת הרזולוציה על מידול הליגנדות ומולקולות הממס במפות cryoEM, ומוצגת השקפה על האופן שבו ניתן להשתמש ב- cryoEM בגילוי תרופות.

Introduction

תאים משיגים את תפקידיהם על ידי ביצוע אינספור תגובות כימיות בו זמנית ובאופן עצמאי, כל אחת מווסתת בקפידה כדי להבטיח את הישרדותם ואת יכולת ההסתגלות שלהם בתגובה לרמזים סביבתיים. זה מושג על ידי זיהוי מולקולרי, המאפשר ביומולקולות, במיוחד חלבונים, ליצור קומפלקסים חולפים או יציבים עם מקרומולקולות אחרות, כמו גם מולקולות קטנות או ליגנדות1. לפיכך, אינטראקציות חלבון-ליגנד הן בסיסיות לכל התהליכים בביולוגיה, הכוללים את ויסות ביטוי ופעילות החלבון, זיהוי מצעים וקו-פקטורים על ידי אנזימים, כמו גם כיצד תאים תופסים ומעבירים אותות 1,2. הבנה טובה יותר של התכונות הקינטיות, התרמודינמיות והמבניות של קומפלקס החל....

Protocol

1. מידול phosphoenolpyruvate (PEP) ב enolase מ Mycobacterium tuberculosis

  1. זיהוי צפיפות ליגנד במפת cryoEM של קומפלקס PEP-enolase
    1. הורד את חצאי המפות הלא מחודדות (emd_30988_additional_1.map ו- emd_30988_additional_2.map) של apo-enolase מהנתונים הנוספים ב- EMDB (ראה טבלת חומרים).
    2. פתח את ChimeraX (ראה טבלת חומרים). פתח את ח?.......

Representative Results

דוגמה 1
האנזים אנולאז משחפת מזרז את השלב הלפני אחרון של גליקוליזה וממיר 2-פוספוגליצראט לפוספונולפירובט (PEP), שהוא מתווך חיוני למספר מסלולים מטבוליים44,45. נתוני CryoEM עבור דגימות apo-enolase ו-PEP enolase נאספו באותו גודל פיקסלים של 1.07 Å, ועיבוד התמונה בוצע ?.......

Discussion

השיפורים בחומרה ובתוכנה של המיקרוסקופ הביאו לעלייה במספר מבני ה-cryoEM בשנים האחרונות. למרות שהרזולוציה הגבוהה ביותר שהושגה כרגע ב- cryoEM של חלקיק יחיד היא 1.2 Å 57,58,59, רוב המבנים נקבעים סביב רזולוציית 3-4 Å. מידול ליגנדות במפות ברזולוציה בינונית .......

Acknowledgements

ש"י הוא מקבל את מלגת הדוקטורט מ- DAE-TIFR, והמימון מוכר. KRV מכירה במענק DBT B-Life DBT/PR12422/MED/31/287/2014 ובתמיכת המחלקה לאנרגיה אטומית, ממשלת הודו, תחת פרויקט זיהוי מס'. RTI4006.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
CCP4-8.0Consortium of several instituteshttps://www.ccp4.ac.ukFree for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EMConsortium of several instituteshttps://www.ccpem.ac.uk/download.phpFree for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot Paul Emsley, LMB, Cambridgehttps://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)Consortium of several instituteshttps://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.htmlSoftware inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank Consortium of several instituteshttps://www.ebi.ac.uk/emdb/Public Repository for Electron Microscopy maps
FalconThermo Fisher Scientific https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdfCommercial, camera from Thermo Fisher 
Phenix Consortium of several instituteshttps://phenix-online.org/downloadFree for academic users and includes Coot
Protein Data BankConsortium of several instituteshttps://rcsb.orgPublic database of macromolecular structures
PymolSchrodingerhttps://pymol.org/2/Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
RelionMRC-LMB, Cambridgehttps://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.htmlSoftware for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan KriosThermo Fisher Scientific https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c&
gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA
AkZesWC4FYQSwIQRk
ZApkj08MfYG040DtiiuL8
RihoCebEQAvD_BwE
Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF ChimeraUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.htmlGeneral purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera XUCSF, USAhttps://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/General purpose software for display, analysis and more

References

  1. Steinbrecher, T., Labahn, A. Towards accurate free energy calculations in ligand protein-binding studies. Curr Med Chem. 17, 767-785 (2010).
  2. Fu, Y., Zhao, J., Chen, Z.

Explore More Articles

JoVE209

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved