Modelagem de ligantes em mapas derivados da criomicroscopia eletrônica

Summary

Este protocolo apresenta as ferramentas disponíveis para modelar ligantes de moléculas pequenas em mapas crioEM de macromoléculas.

Abstract

Decifrar as interações proteína-ligante em um complexo macromolecular é crucial para entender o mecanismo molecular, os processos biológicos subjacentes e o desenvolvimento de medicamentos. Nos últimos anos, a microscopia eletrônica de amostra criogênica (cryoEM) surgiu como uma técnica poderosa para determinar as estruturas de macromoléculas e investigar o modo de ligação do ligante em resolução quase atômica. Identificar e modelar moléculas não proteicas em mapas cryoEM é muitas vezes um desafio devido à resolução anisotrópica em toda a molécula de interesse e ao ruído inerente aos dados. Neste artigo, os leitores são apresentados a vários softwares e métodos atualmente usados para identificação de ligantes, construção de modelos e refinamento de coordenadas atômicas usando macromoléculas selecionadas. Uma das maneiras mais simples de identificar a presença de um ligante, conforme ilustrado com a enzima enolase, é subtrair os dois mapas obtidos com e sem o ligante. A densidade extra do ligante provavelmente se destacará no mapa de diferenças, mesmo em um limite mais alto. Há casos, como mostrado no caso do receptor metabotrópico de glutamato mGlu₅, em que esses mapas de diferença simples não podem ser gerados. O método recentemente introduzido de derivar o mapa de omitir Fo-Fc pode servir como uma ferramenta para validar e demonstrar a presença do ligante. Finalmente, usando a bem estudada β-galactosidase como exemplo, o efeito da resolução na modelagem dos ligantes e moléculas de solvente em mapas de crioEM é analisado e uma perspectiva de como o cryoEM pode ser usado na descoberta de medicamentos é apresentada.

Introduction

As células realizam suas funções realizando inúmeras reações químicas simultânea e independentemente, cada uma meticulosamente regulada para garantir sua sobrevivência e adaptabilidade em resposta a estímulos ambientais. Isso é obtido pelo reconhecimento molecular, que permite que as biomoléculas, especialmente as proteínas, formem complexos transitórios ou estáveis com outras macromoléculas, bem como pequenas moléculas ou ligantes¹. Assim, as interações proteína-ligante são fundamentais para todos os processos da biologia, que incluem a regulação da expressão e atividade proteica, o reconhecimento de substratos e cofatores por enzimas, bem com....

Protocol

1. Modelagem de fosfoenolpiruvato (PEP) em enolase de Mycobacterium tuberculosis

1. Identificação da densidade do ligante no mapa crioEM do complexo PEP-enolase
   1. Faça o download dos semimapas não nitidos (emd_30988_additional_1.map e emd_30988_additional_2.map) da apo-enolase a partir dos dados adicionais no EMDB (consulte a Tabela de Materiais).
   2. Abra o ChimeraX (consulte a Tabela de Materiais). Abra os meios-mapas de apo-enolase clic.......

Discussion

As melhorias no hardware e software do microscópio resultaram em um aumento no número de estruturas crioEM nos últimos anos. Embora a resolução mais alta alcançada no momento em crioEM de partícula única seja de 1,2 Å 57,58,59, a maioria das estruturas está sendo determinada em torno de 3-4 Å de resolução. A modelagem de ligantes em mapas de média a baixa resolução pode ser complicada e muitas vezes repleta de am.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
CCP4-8.0	Consortium of several institutes	https://www.ccp4.ac.uk	Free for academic users and includes Coot and list of tools developed for X-ray crystallography
CCP-EM	Consortium of several institutes	https://www.ccpem.ac.uk/download.php	Free for academic users and includes Coot, Relion and many others
Coot	Paul Emsley, LMB, Cambridge	https://www2.mrc-lmb.cam.ac.uk/personal/pemsley/coot/	General software for model building but also available with other suites described above
DockinMap (Phenix)	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/documentation/reference/dock_in_map.html	Software inside the Phenix suite for docking model into cryoEM maps
Electron Microscopy Data Bank	Consortium of several institutes	https://www.ebi.ac.uk/emdb/	Public Repository for Electron Microscopy maps
Falcon	Thermo Fisher Scientific	https://assets.thermofisher.com/TFS-Assets/MSD/Technical-Notes/Falcon-3EC-Datasheet.pdf	Commercial, camera from Thermo Fisher
Phenix	Consortium of several institutes	https://phenix-online.org/download	Free for academic users and includes Coot
Protein Data Bank	Consortium of several institutes	https://rcsb.org	Public database of macromolecular structures
Pymol	Schrodinger	https://pymol.org/2/	Molecular viusalization tool. Educational version is free but comes with limitation. The full version can be obtained with a small fee.
Relion	MRC-LMB, Cambridge	https://relion.readthedocs.io/en/release-4.0/Installation.html	Software for cryoEM image processing, also available with CCP-EM
Titan Krios	Thermo Fisher Scientific	https://www.thermofisher.com/in/en/home/electron-microscopy/products/transmission-electron-microscopes/krios-g4-cryo-tem.html?cid=msd_ls_xbu_xmkt_tem-krios_285811_gl_pso_gaw_tpne1c& gad_source=1&gclid=CjwKCAiA-P-rBhBEEiwAQEXhHyw5c8MKThmdA AkZesWC4FYQSwIQRk ZApkj08MfYG040DtiiuL8 RihoCebEQAvD_BwE	Commercial, cryoTEM from Thermo Fisher
UCSF Chimera	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimera/download.html	General purpose software for display, analysis and more
UCSF Chimera X	UCSF, USA	https://www.cgl.ucsf.edu/chimerax/	General purpose software for display, analysis and more