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  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O sequenciamento de RNA de quantificação absoluta (AQRNA-seq) é uma tecnologia desenvolvida para quantificar a paisagem de todos os pequenos RNAs em misturas biológicas. Aqui, as etapas de preparação da biblioteca e processamento de dados do AQRNA-seq são demonstradas, quantificando as mudanças no pool de RNA de transferência (tRNA) em Mycobacterium bovis BCG durante a dormência induzida por fome.

Abstract

O AQRNA-seq fornece uma relação linear direta entre o sequenciamento de contagens de leitura e pequenos números de cópias de RNA em uma amostra biológica, permitindo assim a quantificação precisa do conjunto de pequenos RNAs. O procedimento de preparação da biblioteca AQRNA-seq descrito aqui envolve o uso de ligantes de sequenciamento personalizados e uma etapa para reduzir as modificações do RNA de metilação que bloqueiam a processividade da transcrição reversa, o que resulta em um aumento do rendimento de cDNAs de comprimento total. Além disso, é apresentada uma implementação detalhada do pipeline de bioinformática que o acompanha. Esta demonstração de AQRNA-seq foi conduzida por meio de uma análise quantitativa dos 45 tRNAs em Mycobacterium bovis BCG colhidos em 5 dias selecionados em um curso de 20 dias de privação de nutrientes e 6 dias de ressuscitação. Os esforços contínuos para melhorar a eficiência e o rigor do AQRNA-seq também serão discutidos aqui. Isso inclui explorar métodos para evitar a purificação do gel para mitigar os problemas de dímero do primer após a amplificação por PCR e aumentar a proporção de leituras completas para permitir um mapeamento de leitura mais preciso. Aprimoramentos futuros do AQRNA-seq serão focados em facilitar a automação e a implementação de alto rendimento dessa tecnologia para quantificar todas as pequenas espécies de RNA em amostras de células e tecidos de diversos organismos.

Introduction

O sequenciamento de próxima geração (NGS), também conhecido como sequenciamento massivamente paralelo, é uma tecnologia de sequenciamento de DNA que envolve fragmentação de DNA, ligação de oligonucleotídeos adaptadores, amplificação baseada em reação em cadeia da polimerase (PCR), sequenciamento do DNA e remontagem das sequências de fragmentos em um genoma. A adaptação do NGS ao RNA de sequência (RNA-seq) é uma abordagem poderosa para identificar e quantificar transcritos de RNA e suas variantes1. Desenvolvimentos inovadores nos fluxos de trabalho de preparação de bibliotecas de RNA e pipelines de análise bioinformática, juntamente com avanços ....

Protocol

NOTA: A Figura 1 fornece uma ilustração gráfica dos procedimentos envolvidos na preparação da biblioteca AQRNA-seq. Informações detalhadas sobre os reagentes, produtos químicos e colunas/kits usados no procedimento podem ser encontradas na Tabela de Materiais. Recomenda-se realizar uma avaliação abrangente da pureza, integridade e quantidade das amostras de RNA de entrada usando (i) eletroforese em gel de agarose a 3%, (ii) ferramentas de eletroforese automatizadas.......

Representative Results

Mycobacterium bovis A cepa BCG (bacilos de Calmette et Guérin) 1173P2 em crescimento exponencial foi submetida a uma série temporal (0, 4, 10 e 20 dias) de falta de nutrientes, seguida por uma ressuscitação de 6 dias em meio rico em nutrientes, conforme apresentado anteriormente em Hu et al.7. Pequenos RNAs foram isolados da cultura bacteriana, com três repetições biológicas, em cada um dos cinco pontos de tempo designados. As bibliotecas Illumina foram construídas usando o fluxo.......

Discussion

O fluxo de trabalho de preparação da biblioteca AQRNA-seq foi projetado para maximizar a captura de RNAs em uma amostra e minimizar a queda da polimerase durante a transcrição reversa7. Por meio de uma ligação de ligante em duas etapas, novos oligos de DNA (Linker 1 e Linker 2) são ligados em excesso para complementar totalmente o RNA dentro da amostra. O excesso de ligantes pode ser removido de forma eficiente com RecJf, uma exonuclease de 5' a 3' específica para DNAs de fita simples, dei.......

Disclosures

P.C.D. é inventor de duas patentes (PCT/US2019/013714, US 2019/0284624 A1) relacionadas ao trabalho publicado.

Acknowledgements

Os autores do presente trabalho agradecem aos autores do artigo original que descreve a tecnologia AQRNA-seq7. Este trabalho foi apoiado por doações dos Institutos Nacionais de Saúde (ES002109, AG063341, ES031576, ES031529, ES026856) e da Fundação Nacional de Pesquisa de Cingapura por meio da Aliança Cingapura-MIT para Pesquisa e Tecnologia Resistência Antimicrobiana IRG.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
2-ketoglutarate Sigma-Aldrich75890Prepare a working solution (1 M) and store it at -20ºC
2100 Bioanalyzer InstrumentAgilentG2938C
5'-deadenylase (50 U/μL) New England BiolabsM0331S (component #: M0331SVIAL)Store at -20 °C
Adenosine 5'-Triphosphate (ATP) New England BiolabsM0437M (component #: N0437AVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
AGAROSE GPG/LEAmericanBioAB00972-00500Store at ambient temperature
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrateSigma-AldrichF2262Prepare a working solution (0.25 M) and store it at -20 °C
Bioanalyzer Small RNA AnalysisAgilent5067-1548 The Small RNA Analysis is used for checking the quality of input RNAs and the efficiency of enzymatic reactions (e.g., Linker 1 ligation)
Bovine Serum Albumin (BSA; 10 mg/mL) New England BiolabsB9000This product was discontinued on 12/15/2022 and is replaced with Recombinant Albumin, Molecular Biology Grade (NEB B9200).
Chloroform Macron Fine Chemicals4441-10
Demethylase ArrayStarAS-FS-004Demethylase comes with the rtStar tRNA Pretreatment & First-Strand cDNA Synthesis Kit (AS-FS-004)
Deoxynucleotide (dNTP) Solution MixNew England BiolabsN0447L (component #: N0447LVIAL)This dNTP Solution Mix contains equimolar concentrations of dATP, dCTP, dGTP and dTTP (10 mM each)
Digital Dual Heat BlockVWR Scientific Products13259-052Heating block is used with the QIAquick Gel Extraction Kit 
DyeEx 2.0 Spin Kit Qiagen63204 Effective at removing short remnants (e.g., oligos less than 10 bp in length)
Electrophoresis Power SupplyBio-Rad LabrotoriesPowerPac 300
Eppendorf PCR Tubes (0.5 mL)Eppendorf0030124537
Eppendorf Safe-Lock Tubes (0.5 mL)Eppendorf022363611
Eppendorf Safe-Lock Tubes (1.5 mL)Eppendorf022363204
Eppendorf Safe-Lock Tubes (2 mL)Eppendorf022363352
Ethyl alcohol (Ethanol), PureSigma-AldrichE7023 The pure ethanol is used with the Oligo Clean and Concentrator Kit from Zymo Research
Gel Imaging SystemAlpha InnotechFluorChem 8900
Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDSNew England BiolabsN0556S (component #: B7025SVIAL)NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
GENESYS 180 UV-Vis SpectrophotometerThermo Fisher Scientific840-309000The spectrophotometer is used for measuring the oligo concentrations using the Beer's law
HEPESSigma-AldrichH4034Prepare a working solution (1 M; pH = 8 with NaOH) and store it at -20 °C
Hydrochloric acid (HCl) VWR Scientific ProductsBDH3028 Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
Isopropyl Alcohol (Isopropanol), PureMacron Fine Chemicals3032-16Isopropanol is used with the QIAquick Gel Extraction Kit 
L-Ascorbic acidSigma-AldrichA5960Prepare a working solution (0.5 M) and store it at -20ºC
MicrocentrifugeEppendorf5415D
NanoDrop 2000 SpectrophotometerThermo Fisher ScientificND-2000
NEBuffer 2 (10X)New England BiolabsM0264L (component #: B7002SVIAL)NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
Nuclease-Free Water (not DEPC-Treated)Thermo Fisher ScientificAM9938 
Oligo Clean & Concentrator Kit Zymo ResearchD4061 Store at ambient temperature
PEG 8000 (50% solution) New England BiolabsM0437M (component #: B1004SVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM); prepare a working solution (10 mM) and store it at -20ºC
Peltier Thermal CyclerMJ ResearchPTC-200
Phenol:choloroform:isoamyl alcohol 25:24:1 pH = 5.2 Thermo Fisher ScientificJ62336 
PrimeScript Buffer (5X)TaKaRa2680A 
PrimeScript Reverse TranscriptaseTaKaRa2680A 
QIAquick Gel Extraction Kit Qiagen28704This kit requires a heating block and isopropanol to work with
Quick-Load Purple 100 bp DNA LadderNew England BiolabsN0551S (component #: N0551SVIAL)
Quick-Load Purple 50 bp DNA LadderNew England BiolabsN0556S (component #: N0556SVIAL)NEB N0556S contains Quick-Load Purple 50 bp DNA Ladder and Gel Loading Dye, Purple (6X), no SDS
RecJf (30 U/μL) New England BiolabsM0264L (component #: M0264LVIAL)NEB M0264L contains RecJf (30 U/μL) and NEBuffer 2 (10X); store at -20 °C
RNase Inhibitor (murine; 40 U/μL) New England BiolabsM0314L (component #: M0314LVIAL)Store at -20 °C
SeqAMP DNA Polymerase TaKaRa638509 TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
SeqAMP PCR Buffer (2X) TaKaRa638509 TaKaRa 638509 contains SeqAMP DNA Polymerase and SeqAMP PCR Buffer (2X)
Shrimp Alkaline Phosphatase (1 U/μL) New England BiolabsM0371L (component #: M0371LVIAL)
Sodium hydroxide (NaOH)Sigma-Aldrich S5881Prepare a working solution (5 M) and store it at ambient temperature
T4 DNA Ligase (400 U/μL) New England BiolabsM0202L (component #: M0202LVIAL)NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X) New England BiolabsM0202L (component #: B0202SVIAL)NEB M0202L contains T4 DNA Ligase (400 U/μL) and T4 DNA Ligase Reaction Buffer (10X)
T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL) New England BiolabsM0437M (component #: M0437MVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)
T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X) New England BiolabsM0437M (component #: B0216SVIAL)NEB M0437M contains T4 RNA Ligase 1 (30 U/μL), T4 RNA Ligase Reaction Buffer (10X), PEG 8000 (1X), and ATP (100 mM)

References

  1. Byron, S. A., Van Keuren-Jensen, K. R., Engelthaler, D. M., Carpten, J. D., Craig, D. W. Translating RNA sequencing into clinical diagnostics: opportunities and challenges. Nat Rev Gen. 17 (5), 257-271 (2016).
  2. Grillone, K., et al.

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Palavras chave AQRNA seqQuantifica o de RNA PequenoContagem de Leitura de SequenciamentoRela o LinearModifica es de RNA de Metila oPipeline de Bioinform ticaQuantifica o de TRNAMycobacterium Bovis BCGPriva o de NutrientesRessuscita oD mero de PrimerLeituras CompletasMapeamento de LeituraImplementa o de Alto Rendimento

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