ניטור תנודות צירקדיות עם כתב ביולומינסנציה באורגנואידים

Summary

מקצבים צירקדיים, הקיימים ברוב האורגניזמים, מווסתים את הארגון הזמני של תהליכים ביולוגיים. אורגנואידים תלת-ממדיים התגלו לאחרונה כמודל רלוונטי מבחינה פיזיולוגית במבחנה . פרוטוקול זה מתאר את השימוש בכתבים ביולומינסנטיים כדי לצפות במקצבים צירקדיים באורגנואידים, ומאפשר חקירות חוץ גופיות של מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות.

Abstract

לרוב האורגניזמים החיים יש מקצבים צירקדיים, שהם תהליכים ביולוגיים המתרחשים בפרק זמן של כ-24 שעות ומווסתים רפרטואר מגוון של תהליכים תאיים ופיזיולוגיים, החל ממחזורי שינה-ערות ועד חילוף חומרים. מנגנון שעון זה מאמן את האורגניזם בהתבסס על שינויים סביבתיים ומתאם את הוויסות הזמני של אירועים מולקולריים ופיזיולוגיים. בעבר, הוכח כי מקצבים צירקדיים אוטונומיים נשמרים אפילו ברמת התא הבודד באמצעות קווי תאים כגון פיברובלסטים NIH3T3, אשר סייעו בחשיפת המנגנונים של מקצבים צירקדיים. עם זאת, קווי תאים אלה הם תרביות הומוגניות חסרות רב-תאיות ותקשורת בין-תאית חזקה. בעשור האחרון נעשתה עבודה נרחבת על פיתוח, אפיון ויישום של אורגנואידים תלת-ממדיים, שהם מערכות רב-תאיות במבחנה המזכירות מבנים ופונקציות מורפולוגיות in vivo . מאמר זה מתאר פרוטוקול לזיהוי מקצבים צירקדיים באמצעות כתב ביולומינסנטי באנטרואידים של מעיים אנושיים, המאפשר לחקור מקצבים צירקדיים במערכות רב-תאיות במבחנה.

Introduction

שעון ביולוגי
לכל האורגניזמים, מחיידקים ועד יונקים, יש מערכת יחסים מורכבת ודינמית עם סביבתם. בתוך מערכת יחסים זו, הסתגלות לשינויים סביבתיים היא קריטית להישרדותם של אורגניזמים. לרוב האורגניזמים יש מקצבים צירקדיים המאפשרים להם להסתגל ולייעל את תפקודיהם למחזורים יומיים של כ-24 שעות. השעון הצירקדי הוא רשת היררכית של שעונים מרכזיים והיקפיים הפועלים בשיתוף פעולה כדי לשמור על הומאוסטזיס פיזיולוגי ולשמור על אורגניזמים מסונכרנים עם שינויים יומיים ^1,2. ביונקים, השעון המרכזי או השעון הראשי הממוקם בגרעין העל-תצלומי (SCN) מקבל רמזים חיצוניים, כגון אור, ומעביר את המידע לשעונים ההיקפיים באמצעות משחק גומלין....

Protocol

כל הניסויים באמצעות רקמות אנושיות ליצירת HIEs אושרו על ידי IRB ב- CCHMC (IRB #2014-0427). עיין בטבלת החומרים לקבלת פרטים הקשורים לכל החומרים המשמשים בפרוטוקול זה.

הערה: כדי להמחיש את ההליך המתואר בפרוטוקול זה, השתמשנו באנטרואידים של המעי האנושי Bmal1-luc (HIEs). אנטרואידים אלה עבר?.......

Discussion

בדיקת Bioluminescence מציעה מספר יתרונות לחקר מקצבים צירקדיים, הדורשים איסוף נתונים מניסויי מסלול ארוכי טווח. ראשית, הוא מאפשר לחוקרים לעקוב אחר ביטוי הגן או החלבון המעניין בזמן שתאים נעים ומתרבים. מבלי לבצע התאמות מיותרות או לשבש את תפקודי התאים, ניתן לתעד אירועים תאיים מתעניינים או ביטוי גנים ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
35 x 10 Falcon tissue culture dishes	Fisher Scientific	08-772A
A 83-01	Sigma Aldrich	SML0788
Advanced DMEM/F12	Life Technologies	12634-028
B-27 Supplement (50x)	Gibco	17504-044
BD Micro-Fine IV Insulin Syringes	Fisher Scientific	14-829-1Bb	Mfrn: BD 329424
CHIR99021	Cayman Chemical	13122	GSK-3 inhibitor
Dexamethasone	Sigma Aldrich	D4902-500MG
D-Luciferin (potassium salt)	Cayman Chemical	14681
Gastrin I Human	Sigma Aldrich	G9020
GlutaMAX	Gibco	35050061
Growth Factor reduced (GFR) Matrigel	Corning	CB-40230C
HEPES	Gibco	15630080
IntestiCult Organoid Growth Medium (Human)	Stemcell Technologies	06010	Consist of IntestiCult OGM Human Basal Medium, 50 mL and Organoid Supplement, 50 mL. Mix both as 1:1 ratio to use as intestinal organoid growth medium
Kronos Dio Luminometer Machine	ATTO Corporation	AB-2550
N-2 Supplement (100x)	Gibco	17502-048
N-Acetyl-L-cysteine	Sigma Aldrich	A9165
pABpuro-BluF reporter plasmid	Addgene	46824
PBS without Calcium and Magnesium	Corning	21-040-CV
Penicillin-Streptomycin	Gibco	15140122
Recombinant murine EGF	PeproTech	315-09
Y-27632	R&D Systems	1254/10	ROCK inhibitor