Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

אנו מתארים בדיקה פלואורסצנטית שיכולה לאשר במהירות ובזול את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל. הבדיקה מודדת את יכולתן של תרכובות להתחרות בפעילות קשירת הברזל של הגשושית הפלואורסצנטית החלשה Calcein, וכתוצאה מכך עלייה ניתנת לכימות בפלואורסצנטיות כאשר מתרחשת כלציה.

Abstract

תאים סרטניים דורשים כמויות גדולות של ברזל כדי לשמור על התפשטותם. מטבוליזם של ברזל נחשב לסימן היכר של סרטן, מה שהופך את הברזל למטרה תקפה לגישות אנטי-סרטניות. פיתוח תרכובות חדשניות וזיהוי לידים לשינוי נוסף מחייב ביצוע בדיקות הוכחת מנגנון. ישנם מבחנים רבים להערכת ההשפעה על ההתפשטות; עם זאת, היכולת לכלאט ברזל היא מדד חשוב שלעתים מתעלמים ממנו בשל העלויות הגבוהות של הציוד והאתגר לכמת במהירות ובאופן משכפל את חוזק הקלציה. במאמר זה אנו מתארים שיטה פלואורסצנטית נטולת תאים הניתנת לכימות וזולה כדי לאשר את יכולתן של תרכובות חדשות לכלאט ברזל. הבדיקה שלנו מסתמכת על הצבע הפלואורסצנטי הזול הזמין מסחרית Calcein, אשר ניתן לכמת את הפלואורסצנטיות שלו על רוב קוראי לוחות מיקרוטיטר פלואורסצנטיים. קלצין הוא כלטור ברזל חלש, והפלואורסצנטיות שלו מרוה כאשר הוא קושר את Fe2+/3+; פלואורסצנטיות משוחזרת כאשר כלטור חדש מתחרה בקלצין על Fe2+/3+ כבול. הסרת מרווה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך עלייה פלואורסצנטית מאפשרת לקבוע את יכולת הקלציה של כלטור משוער חדש. לכן, אנו מציעים בדיקה זולה ובעלת תפוקה גבוהה המאפשרת סינון מהיר של תרכובות כלטור מועמדות חדשניות.

Introduction

שינויים פנוטיפיים בתאים הקשורים להתפתחות סרטן באמצעות קבוצה משותפת של יכולות ביולוגיות משתנות מכונים כיום בדרך כלל סימני ההיכר של סרטן. ביניהם שינויים הנובעים מתכנות מחדש של מטבוליזם של אנרגיה, הנפוצים בביולוגיה של התא הסרטני1. תכנות מחדש מטבולי כזה כולל דרישה מוגברת לברזל לתמיכה בהתרבות מהירה ובצמיחת הגידול2. צמא זה לברזל מוביל למטבוליזם ברזל לא מווסת, אשר כשלעצמו נחשב סימן ההיכר של סרטן 3,4, עם חוסר ויסות המתרחש בכל השלבים5. סימני ההיכר של גרורות, שהוצעו לאחרונה על ידי וולש והרסט, כוללים תפקיד לברזל

Protocol

1. הכנת פתרון מלאי

  1. בעת הכנת פתרונות מלאי Calcein, למנוע השפלת תמונה על ידי שמירה על פתרונות בחושך. הכינו תמיסה של 1 mM של Calcein ב- PBS של Dulbecco, ללא מגנזיום או סידן14. עבור 5 מ"ל של 1 מ"מ תמיסת Calcein, להוסיף 3.1 מ"ג של Calcein (622.5 גרם / M) ל 5 מ"ל של PBS של Dulbecco. באמצעות גרב 1 m.......

Representative Results

עבור השיטה שמוצגת בשלב 2, הניסוי הראשון הזה (איור 1) קבע את הטווח הליניארי של קורא הלוחות הפלואורסצנטיים של מיקרוטיטר בעת זיהוי פליטות פלואורסצנטיות של קלצאין. התוצאות המייצגות שלנו מראות טווח ליניארי רחב של פלואורסצנטיות Calcein בין 0-100 μM. ANOVA עם ניתוח LSD לאח?.......

Discussion

הסתמכות היתר של סוגי סרטן על ברזל כדי לתדלק את חילוף החומרים שלהם הופכת את כלציית הברזל לתוספת פוטנציאלית למשטרים טיפוליים4. עם זאת, קיימת יכולת מוגבלת לסנן במהירות כלטורים חדשים של יוני מתכת בשל יכולתם לקשור יוני ברזל. הגשושית הפלואורסצנטית הנפוצה והנפוצה .......

Disclosures

המחברים מצהירים כי אין ניגוד עניינים.

Acknowledgements

ברצוננו להודות לאוניברסיטת נורת'מבריה על תמיכתם.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrateSigma-Aldrich215406other wise known as FAS
CalceinSigma-AldrichC0875
DeferiproneSigma-Aldrich379409
Dulbecco′s Phosphate Buffered SalineSigma-AldrichD5652magnesium and calcium free
Greiner CELLSTAR 96 well platesSigma-AldrichM0812any optically transparent 96 well plate will work

References

  1. Hsu, P. P., Sabatini, D. M. Cancer cell metabolism: Warburg and beyond. Cell. 134 (5), 703-707 (2008).
  2. Hsu, M. Y., Mina, E., Roetto, A., Porporato, P. E. Iron: An essential element of cancer metabolism. Cells. 9 (12....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved