שיטה פלואורסצנטית ניתנת לכימות וזולה ללא תאים כדי לאשר את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל

Summary

אנו מתארים בדיקה פלואורסצנטית שיכולה לאשר במהירות ובזול את היכולת של תרכובות חדשות לכלאט ברזל. הבדיקה מודדת את יכולתן של תרכובות להתחרות בפעילות קשירת הברזל של הגשושית הפלואורסצנטית החלשה Calcein, וכתוצאה מכך עלייה ניתנת לכימות בפלואורסצנטיות כאשר מתרחשת כלציה.

Abstract

תאים סרטניים דורשים כמויות גדולות של ברזל כדי לשמור על התפשטותם. מטבוליזם של ברזל נחשב לסימן היכר של סרטן, מה שהופך את הברזל למטרה תקפה לגישות אנטי-סרטניות. פיתוח תרכובות חדשניות וזיהוי לידים לשינוי נוסף מחייב ביצוע בדיקות הוכחת מנגנון. ישנם מבחנים רבים להערכת ההשפעה על ההתפשטות; עם זאת, היכולת לכלאט ברזל היא מדד חשוב שלעתים מתעלמים ממנו בשל העלויות הגבוהות של הציוד והאתגר לכמת במהירות ובאופן משכפל את חוזק הקלציה. במאמר זה אנו מתארים שיטה פלואורסצנטית נטולת תאים הניתנת לכימות וזולה כדי לאשר את יכולתן של תרכובות חדשות לכלאט ברזל. הבדיקה שלנו מסתמכת על הצבע הפלואורסצנטי הזול הזמין מסחרית Calcein, אשר ניתן לכמת את הפלואורסצנטיות שלו על רוב קוראי לוחות מיקרוטיטר פלואורסצנטיים. קלצין הוא כלטור ברזל חלש, והפלואורסצנטיות שלו מרוה כאשר הוא קושר את Fe^2+/3+; פלואורסצנטיות משוחזרת כאשר כלטור חדש מתחרה בקלצין על Fe^2+/3+ כבול. הסרת מרווה פלואורסצנטית וכתוצאה מכך עלייה פלואורסצנטית מאפשרת לקבוע את יכולת הקלציה של כלטור משוער חדש. לכן, אנו מציעים בדיקה זולה ובעלת תפוקה גבוהה המאפשרת סינון מהיר של תרכובות כלטור מועמדות חדשניות.

Introduction

שינויים פנוטיפיים בתאים הקשורים להתפתחות סרטן באמצעות קבוצה משותפת של יכולות ביולוגיות משתנות מכונים כיום בדרך כלל סימני ההיכר של סרטן. ביניהם שינויים הנובעים מתכנות מחדש של מטבוליזם של אנרגיה, הנפוצים בביולוגיה של התא הסרטני¹. תכנות מחדש מטבולי כזה כולל דרישה מוגברת לברזל לתמיכה בהתרבות מהירה ובצמיחת הגידול². צמא זה לברזל מוביל למטבוליזם ברזל לא מווסת, אשר כשלעצמו נחשב סימן ההיכר של סרטן ^3,4, עם חוסר ויסות המתרחש בכל השלבים⁵. סימני ההיכר של גרורות, שהוצעו לאחרונה על ידי וולש והרסט, כוללים תפקיד לברזל

Protocol

1. הכנת פתרון מלאי

1. בעת הכנת פתרונות מלאי Calcein, למנוע השפלת תמונה על ידי שמירה על פתרונות בחושך. הכינו תמיסה של 1 mM של Calcein ב- PBS של Dulbecco, ללא מגנזיום או סידן¹⁴. עבור 5 מ"ל של 1 מ"מ תמיסת Calcein, להוסיף 3.1 מ"ג של Calcein (622.5 גרם / M) ל 5 מ"ל של PBS של Dulbecco. באמצעות גרב 1 m.......

Discussion

הסתמכות היתר של סוגי סרטן על ברזל כדי לתדלק את חילוף החומרים שלהם הופכת את כלציית הברזל לתוספת פוטנציאלית למשטרים טיפוליים⁴. עם זאת, קיימת יכולת מוגבלת לסנן במהירות כלטורים חדשים של יוני מתכת בשל יכולתם לקשור יוני ברזל. הגשושית הפלואורסצנטית הנפוצה והנפוצה .......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	215406	other wise known as FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D5652	magnesium and calcium free
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Sigma-Aldrich	M0812	any optically transparent 96 well plate will work