Количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо

Summary

Мы описываем флуоресцентный анализ, который может быстро и недорого подтвердить способность новых соединений хелатировать железо. В ходе анализа измеряется способность соединений вытеснять железосвязывающую активность слабого хелатирующего железа флуоресцентного зонда кальцеина, что приводит к количественно измеримому увеличению флуоресценции при хелировании.

Abstract

Раковым клеткам требуется большое количество железа для поддержания их пролиферации. Метаболизм железа считается отличительной чертой рака, что делает железо подходящей мишенью для противораковых подходов. Разработка новых соединений и идентификация отведений для дальнейшей модификации требует проведения тестов на доказательство механизма. Существует множество анализов для оценки воздействия на распространение; Тем не менее, способность хелатировать железо является важной и иногда упускаемой из виду конечной мерой из-за высокой стоимости оборудования и проблемы быстрой и воспроизводимой количественной оценки силы хелатирования. В этой статье мы описываем количественный и недорогой бесклеточный флуоресцентный метод для подтверждения способности новых соединений хелатировать железо. Наш анализ основан на коммерчески доступном недорогом флуоресцентном красителе кальцеин, флуоресценция которого может быть количественно определена на большинстве флуоресцентных микротитровальных планшетов. Кальцеин является слабым хелатором железа, и его флуоресценция гасится, когда он связывает Fe^2+/3+; Флуоресценция восстанавливается, когда новый хелатор превосходит кальцеин по связанному Fe^2+/3+. Устранение флуоресцентного гашения и, как следствие, увеличение флуоресценции позволяет определить хелатирующую способность нового предполагаемого хелатора. Поэтому мы предлагаем недорогой высокопроизводительный анализ, который позволяет проводить быстрый скрининг новых химических соединений-кандидатов.

Introduction

Фенотипические изменения в клетках, которые связаны с развитием рака через общий набор измененных биологических возможностей, в настоящее время обычно называют признаками рака. К их числу относятся изменения, возникающие в результате перепрограммирования энергетического обмена, которые широко распространены в биологии раковых клеток¹. Такое метаболическое перепрограммирование включает в себя повышенную потребность в железе для поддержки быстрой пролиферации и роста опухоли². Эта тяга к железу приводит к нарушению регуляции метаболизма железа, что само по себе считается признаком рака

Protocol

1. Приготовление исходного раствора

1. При приготовлении стоковых растворов кальцеина предотвратите фотодеградацию, храня растворы в темноте. Приготовьте 1 мМ раствор кальцеина в PBS Дульбекко, без магния или кальция¹⁴. На 5 мл 1 мл раствора кальц.......

Discussion

Чрезмерная зависимость раковых опухолей от железа в качестве топлива для метаболизма делает хелатирование железа потенциальным дополнением к терапевтическим режимам⁴. Тем не менее, существует ограниченная возможность быстрого скрининга новых хелатор?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Ammonium iron(II) sulfate hexahydrate	Sigma-Aldrich	215406	other wise known as FAS
Calcein	Sigma-Aldrich	C0875
Deferiprone	Sigma-Aldrich	379409
Dulbecco′s Phosphate Buffered Saline	Sigma-Aldrich	D5652	magnesium and calcium free
Greiner CELLSTAR 96 well plates	Sigma-Aldrich	M0812	any optically transparent 96 well plate will work