Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקות זיהום כדי לחקור היצמדות לשיגלה , פלישה ושכפול תוך תאי באמצעות קווי תאי אפיתל במבחנה .

Abstract

הפתוגן החיידקי האנטרי המותאם לבני אדם שיגלה גורם למיליוני זיהומים מדי שנה, יוצר השפעות גדילה ארוכות טווח בקרב ילדים ומהווה גורם מוביל למוות משלשולים ברחבי העולם. זיהום גורם לשלשול מימי או דמי כתוצאה מכך שהפתוגן עובר במערכת העיכול ומדביק את תאי האפיתל המצפים את המעי הגס. עם עלייה מדהימה בעמידות לאנטיביוטיקה והמחסור הנוכחי בחיסונים מאושרים, פרוטוקולי מחקר סטנדרטיים הם קריטיים לחקר הפתוגן האימתני הזה. כאן מוצגות מתודולוגיות לבחינת הפתוגנזה המולקולרית של שיגלה באמצעות אנליזות חוץ גופיות של היצמדות חיידקים, פלישה ושכפול תוך-תאי בתאי אפיתל המעי הגס. לפני ניתוח הזיהום, פנוטיפ האלימות של מושבות שיגלה אומת על ידי ספיגת הצבע האדום של קונגו על לוחות אגר. ניתן לשקול גם שימוש בחומרי מעבדה מוספים במהלך תרבית חיידקים כדי לחקות בתנאי in vivo . תאי חיידקים משמשים לאחר מכן בפרוטוקול סטנדרטי כדי להדביק תאי אפיתל המעי הגס בלוחיות תרבית רקמה בריבוי מבוסס של זיהום עם התאמות לנתח כל שלב של זיהום. לצורך בדיקות היצמדות, תאי שיגלה מודגרים עם רמות מדיה מופחתות כדי לקדם מגע חיידקי עם תאי אפיתל. הן עבור פלישה והן עבור מבחני שכפול תוך תאי, גנטמיצין מיושם בפרקי זמן שונים כדי לחסל חיידקים חוץ-תאיים ולאפשר הערכה של פלישה ו / או כימות של שיעורי שכפול תוך תאי. כל פרוטוקולי ההדבקה מונים חיידקים דבקים, פלשו ו / או תוך תאיים על ידי דילול סדרתי של תאי אפיתל נגועים וציפוי יחידות יוצרות מושבת חיידקים ביחס לטיטרים מדביקים על לוחות אגר אדומים בקונגו. יחד, פרוטוקולים אלה מאפשרים אפיון עצמאי והשוואות עבור כל שלב של זיהום Shigella של תאי אפיתל כדי לחקור פתוגן זה בהצלחה.

Introduction

מחלות שלשול הנגרמות על ידי פתוגנים חיידקיים אנטריים מהוות נטל בריאותי עולמי משמעותי. בשנת 2016, מחלות שלשול היו אחראיות ל -1.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם והיו סיבת המוות הרביעית בשכיחותה בקרב ילדים מתחת לגיל חמש שנים של 1,2. הפתוגן החיידקי הגראם-שלילי, האנטרי, שיגלה, הוא הגורם הסיבתי לשיגלוזיס, גורם עיקרי למוות משלשולים ברחבי העולם3. שיגלוזיס גורם לתחלואה ותמותה משמעותית מדי שנה בילדים ממדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית 4,5, בעוד זיהומים במדינות בעלות הכנסה גבוהה קשורים להתפרצויות מעונות יום, מזון ומים 6,7,8,9

Protocol

1. הכנת ריאגנטים וחומרים

הערה: כל אמצעי האחסון תואמים לבדיקה באמצעות שני לוחות בעלי 6 בארות.

  1. TSB בינוני: הוסף 0.5 ליטר מים נטולי יונים(DI) ל-15 גרם של מרק סויה טריפטי (TSB, ראה טבלת חומרים) בינוני ואוטוקלאב. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
  2. מלחי מרה בינוניים (TSB + BS): .......

Representative Results

בדיקות היצמדות, פלישה ושכפול תוך-תאי בוצעו בהשוואה בין S. flexneri 2457T wild type (WT) ל-S. flexneri ΔVF (ΔVF), מוטנט ששיערו כי הוא מווסת באופן שלילי את אלימות Shigella. מכיוון ששיגלה משתמשת במלחי מרה כאות לוויסות אלימות 17,18,47, ניסויים בוצעו לאחר תת-תרבית חיידקית במדיה TSB וכן TSB בתוספת 0.4% (w/v) מ?.......

Discussion

פרוטוקול זה מתאר סדרה של שלוש בדיקות סטנדרטיות לחקר היצמדות לשיגלה, פלישה ושכפול תוך-תאי של תאי אפיתל במעי. למרות ששיטות אלה הן בסך הכל גרסאות מותאמות של מבחני גנטמיצין קלאסיים המשמשים לחקר הפלישה והשכפול התוך-תאי של פתוגנים חיידקיים שונים בתוך תאי המאכסן49,50,51

Acknowledgements

התמיכה במחברים כוללת את המחלקה לרפואת ילדים של בית החולים הכללי של מסצ'וסטס, פרס הוועד המנהל למימון תמיכה זמנית במחקר (ISF) לשנת 2022A009041, מענק המכון הלאומי לאלרגיה ומחלות זיהומיות R21AI146405, והמכון הלאומי לסוכרת ומחלות עיכול וכליות מענק תזונה במרכז המחקר להשמנת יתר בהרווארד (NORCH) 2P30DK040561-26. למממנים לא היה כל תפקיד בעיצוב המחקר, באיסוף הנתונים ובניתוחם, בהחלטה על פרסומם או בהכנת כתב היד.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
0.22 μm PES filterMillipore-SigmaSCGP00525Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubesCorning35205917 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubesCorning43082950 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture platesCorning3516Plates are treated for optimal cell attachment
Bile saltsSigma-AldrichB87561:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dyeSigma-AldrichC6277A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slideInvitrogenC10283To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)Sigma-AldrichD8418A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)Gibco10569-010DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)Sigma-AldrichF4135Heat-inactivated, sterile
GentamicinSigma-AldrichG3632Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell lineATCCHTB-38Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin filmBemisPM999Laboratory sealing film
Petri dishesThermo Fisher ScientificFB0875713100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)Thermo Fisher Scientific100100491x concentration; pH 7.4
Select agarInvitrogen30391023A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasksCorning430641UTissue culture flasks
Triton X-100Sigma-AldrichT8787A common non-ionic surfactant and emulsifier 
Trypan blue stainInvitrogenT10282A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTAGibco25200-056Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)Sigma-AldrichT8907Bacterial growth media

References

Explore More Articles

204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved