ניתוח זיהום תאי אפיתל עם שיגלה

Summary

הפרוטוקול הנוכחי מתאר בדיקות זיהום כדי לחקור היצמדות לשיגלה , פלישה ושכפול תוך תאי באמצעות קווי תאי אפיתל במבחנה .

Abstract

הפתוגן החיידקי האנטרי המותאם לבני אדם שיגלה גורם למיליוני זיהומים מדי שנה, יוצר השפעות גדילה ארוכות טווח בקרב ילדים ומהווה גורם מוביל למוות משלשולים ברחבי העולם. זיהום גורם לשלשול מימי או דמי כתוצאה מכך שהפתוגן עובר במערכת העיכול ומדביק את תאי האפיתל המצפים את המעי הגס. עם עלייה מדהימה בעמידות לאנטיביוטיקה והמחסור הנוכחי בחיסונים מאושרים, פרוטוקולי מחקר סטנדרטיים הם קריטיים לחקר הפתוגן האימתני הזה. כאן מוצגות מתודולוגיות לבחינת הפתוגנזה המולקולרית של שיגלה באמצעות אנליזות חוץ גופיות של היצמדות חיידקים, פלישה ושכפול תוך-תאי בתאי אפיתל המעי הגס. לפני ניתוח הזיהום, פנוטיפ האלימות של מושבות שיגלה אומת על ידי ספיגת הצבע האדום של קונגו על לוחות אגר. ניתן לשקול גם שימוש בחומרי מעבדה מוספים במהלך תרבית חיידקים כדי לחקות בתנאי in vivo . תאי חיידקים משמשים לאחר מכן בפרוטוקול סטנדרטי כדי להדביק תאי אפיתל המעי הגס בלוחיות תרבית רקמה בריבוי מבוסס של זיהום עם התאמות לנתח כל שלב של זיהום. לצורך בדיקות היצמדות, תאי שיגלה מודגרים עם רמות מדיה מופחתות כדי לקדם מגע חיידקי עם תאי אפיתל. הן עבור פלישה והן עבור מבחני שכפול תוך תאי, גנטמיצין מיושם בפרקי זמן שונים כדי לחסל חיידקים חוץ-תאיים ולאפשר הערכה של פלישה ו / או כימות של שיעורי שכפול תוך תאי. כל פרוטוקולי ההדבקה מונים חיידקים דבקים, פלשו ו / או תוך תאיים על ידי דילול סדרתי של תאי אפיתל נגועים וציפוי יחידות יוצרות מושבת חיידקים ביחס לטיטרים מדביקים על לוחות אגר אדומים בקונגו. יחד, פרוטוקולים אלה מאפשרים אפיון עצמאי והשוואות עבור כל שלב של זיהום Shigella של תאי אפיתל כדי לחקור פתוגן זה בהצלחה.

Introduction

מחלות שלשול הנגרמות על ידי פתוגנים חיידקיים אנטריים מהוות נטל בריאותי עולמי משמעותי. בשנת 2016, מחלות שלשול היו אחראיות ל -1.3 מיליון מקרי מוות ברחבי העולם והיו סיבת המוות הרביעית בשכיחותה בקרב ילדים מתחת לגיל חמש שנים של ^1,2. הפתוגן החיידקי הגראם-שלילי, האנטרי, שיגלה, הוא הגורם הסיבתי לשיגלוזיס, גורם עיקרי למוות משלשולים ברחבי העולם³. שיגלוזיס גורם לתחלואה ותמותה משמעותית מדי שנה בילדים ממדינות בעלות הכנסה נמוכה ובינונית ^4,5, בעוד זיהומים במדינות בעלות הכנסה גבוהה קשורים להתפרצויות מעונות יום, מזון ומים ^6,7,8,9

Protocol

1. הכנת ריאגנטים וחומרים

הערה: כל אמצעי האחסון תואמים לבדיקה באמצעות שני לוחות בעלי 6 בארות.

1. TSB בינוני: הוסף 0.5 ליטר מים נטולי יונים(DI) ל-15 גרם של מרק סויה טריפטי (TSB, ראה טבלת חומרים) בינוני ואוטוקלאב. יש לאחסן בטמפרטורת החדר.
2. מלחי מרה בינוניים (TSB + BS): .......

Discussion

פרוטוקול זה מתאר סדרה של שלוש בדיקות סטנדרטיות לחקר היצמדות לשיגלה, פלישה ושכפול תוך-תאי של תאי אפיתל במעי. למרות ששיטות אלה הן בסך הכל גרסאות מותאמות של מבחני גנטמיצין קלאסיים המשמשים לחקר הפלישה והשכפול התוך-תאי של פתוגנים חיידקיים שונים בתוך תאי המאכסן^49,50,51

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
0.22 μm PES filter	Millipore-Sigma	SCGP00525	Sterile, polyethersulfone filter for sterilizing up to 50 mL media
14 mL culture tubes	Corning	352059	17 mm x 100 mm polypropylene test tubes with cap
50 mL conical tubes	Corning	430829	50 mL clear polypropylene conical bottom centrifuge tubes with leak-proof cap
6-well tissue culture plates	Corning	3516	Plates are treated for optimal cell attachment
Bile salts	Sigma-Aldrich	B8756	1:1 ratio of cholate to deoxycholate
Congo red dye	Sigma-Aldrich	C6277	A benzidine-based anionic diazo dye, >85% purity
Countess cell counting chamber slide	Invitrogen	C10283	To be used with the Countess Automated Cell Counter
Dimethyl sulfoxide (DMSO)	Sigma-Aldrich	D8418	A a highly polar organic reagent
Dulbecco’s Modified Eagle Medium (DMEM)	Gibco	10569-010	DMEM is supplemented with high glucose, sodium pyruvate, GlutaMAX, and Phenol Red
Fetal Bovine Serum (FBS)	Sigma-Aldrich	F4135	Heat-inactivated, sterile
Gentamicin	Sigma-Aldrich	G3632	Stock concentration is 50 mg/mL
HT-29 cell line	ATCC	HTB-38	Adenocarcinoma cell line; colorectal in origin
Paraffin film	Bemis	PM999	Laboratory sealing film
Petri dishes	Thermo Fisher Scientific	FB0875713	100 mm x 15 mm Petri dishes for solid media
Phosphate-buffered saline (PBS)	Thermo Fisher Scientific	10010049	1x concentration; pH 7.4
Select agar	Invitrogen	30391023	A mixture of polysaccharides extracted from red seaweed cell walls to make bacterial plating media
T75 flasks	Corning	430641U	Tissue culture flasks
Triton X-100	Sigma-Aldrich	T8787	A common non-ionic surfactant and emulsifier
Trypan blue stain	Invitrogen	T10282	A dye to detect dead tissue culture cells; only live cells can exclude the dye
Trypsin-EDTA	Gibco	25200-056	Reagent for cell dissociation for cell line maintenance and passaging
Tryptic Soy Broth (TSB)	Sigma-Aldrich	T8907	Bacterial growth media