Bioluminescence Resonance Energy Transfer (BRET) - בדיקה מבוססת למדידת אינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים

CRAF הוא גורם משפיע עיקרי על RAS GTPases וממלא תפקיד קריטי בגידולים של מספר סוגי סרטן המונעים על ידי KRAS. בנוסף, CRAF הוא נקודה חמה למוטציות בקו הנבט, אשר הוכחו כגורמות לראסופתיה התפתחותית, תסמונת נונאן. כל הקינאזות של חיל האוויר המלכותי מכילות אתרי קישור מרובים תלויי זרחן עבור 14-3-3 חלבוני רגולציה. הקשירה הדיפרנציאלית של 14-3-3 לאתרים אלה ממלאת תפקיד חיוני ביצירת דימרים פעילים של חיל האוויר המלכותי בקרום הפלזמה בתנאי איתות ובשמירה על עיכוב עצמי של חיל האוויר המלכותי בתנאי שקט. הבנת האופן שבו אינטראקציות אלה מווסתות וכיצד ניתן לווסת אותן היא קריטית לזיהוי גישות טיפוליות חדשות המכוונות לתפקוד חיל האוויר המלכותי. במאמר זה אני מתאר בדיקה מבוססת העברת אנרגיית תהודה ביולומינסנטית (BRET) למדידת האינטראקציות של CRAF עם 14-3-3 חלבונים בתאים חיים. באופן ספציפי, בדיקה זו מודדת את האינטראקציות של CRAF שהתמזגו לתורם ננו לוציפראז ו-14-3-3 התמזגו למקבל תג Halo, כאשר האינטראקציה של RAF ו-14-3-3 גורמת להעברת אנרגיה מתורם למקבל וליצירת אות RET. הפרוטוקול מראה עוד כי אות זה יכול להיות משובש על ידי מוטציות שהוכחו כמונעות קשירה של 14-3-3 לכל אחד מאתרי העגינה של חיל האוויר המלכותי בעל זיקה גבוהה. פרוטוקול זה מתאר את הליכי הזריעה, ההדבקה והציפוי מחדש של התאים, יחד עם הוראות מפורטות לקריאת פליטות BRE, ביצוע ניתוח נתונים ואישור רמות ביטוי חלבונים. בנוסף, תוצאות בדיקה לדוגמה, יחד עם שלבי מיטוב ופתרון בעיות, מסופקים.