Saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per la misurazione delle interazioni di CRAF con proteine 14-3-3 in cellule vive

La CRAF è un effettore primario delle GTPasi RAS e svolge un ruolo critico nella tumorigenesi di diversi tumori guidati da KRAS. Inoltre, la CRAF è un hotspot per le mutazioni germinali, che hanno dimostrato di causare la RASopathy evolutiva, la sindrome di Noonan. Tutte le chinasi RAF contengono più siti di legame dipendenti dalla fosforilazione per le proteine regolatorie 14-3-3. Il legame differenziale di 14-3-3 a questi siti gioca un ruolo essenziale nella formazione di dimeri attivi di RAF sulla membrana plasmatica in condizioni di segnalazione e nel mantenimento dell'autoinibizione di RAF in condizioni di quiescenza. Comprendere come queste interazioni sono regolate e come possono essere modulate è fondamentale per identificare nuovi approcci terapeutici che mirano alla funzione dei RAF. Qui, descrivo un saggio basato sul trasferimento di energia per risonanza di bioluminescenza (BRET) per misurare le interazioni di CRAF con le proteine 14-3-3 nelle cellule vive. In particolare, questo test misura le interazioni di CRAF fuso a un donatore di nano luciferasi e 14-3-3 fuso a un accettore di tag Halo, dove l'interazione di RAF e 14-3-3 determina il trasferimento di energia da donatore a accettore e la generazione del segnale BRET. Il protocollo mostra inoltre che questo segnale può essere interrotto da mutazioni che hanno dimostrato di impedire il legame di 14-3-3 a ciascuno dei suoi siti di attracco RAF ad alta affinità. Questo protocollo descrive le procedure per la semina, la trasfetzione e la riplaccatura delle cellule, insieme a istruzioni dettagliate per la lettura delle emissioni di BRET, l'esecuzione dell'analisi dei dati e la conferma dei livelli di espressione proteica. Inoltre, vengono forniti esempi di risultati dei saggi, insieme alle fasi di ottimizzazione e risoluzione dei problemi.