פרוטוקול זה מציג גישה מפורטת לשכפול מודל מורין של אי ספיקת לב הנגרמת על ידי היפרליפידמיה עם מקטע פליטה שמור (HFpEF). התכנון משלב מתן של וירוס הקשור אדנו, 9-טרופונין לבבי, T-צפיפות נמוכה ליפופרוטאין קולטן (AAV9-cTnT-LDLR) ו poloxamer-407 (P-407).
הפתופיזיולוגיה של אי ספיקת לב עם מקטע פליטה שמור (HFpEF) המונע על ידי lipotoxicity אינו מובן לחלוטין. בהתחשב בצורך הדחוף במודלים של בעלי חיים המחקים במדויק HFpEF לבבי-מטבולי, פותח מודל מורין המושרה על ידי היפרליפידמיה על ידי פנוטיפים של הנדסה לאחור שנצפו בחולי HFpEF. מודל זה נועד לחקור את HFpEF, תוך התמקדות ביחסי הגומלין בין ליפוטוקסיות ותסמונת מטבולית. היפרליפידמיה הושרה בעכברי בר (WT) על רקע זן 129J באמצעות זריקות תוך-שבועיות תוך פריטוניאליות של פולוקסמר-407 (P-407), קו-פולימר בלוק החוסם ליפופרוטאין ליפאז, בשילוב עם זריקה תוך ורידית יחידה של נגיף 9-טרופונין לבבי T-קולטן ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (AAV9-cTnT-LDLR). הערכות מקיפות נערכו בין 4 ל -8 שבועות לאחר הטיפול, כולל אקוקרדיוגרפיה, רישום לחץ דם, פלטיסמוגרפיה של כל הגוף, טלמטריה של אקוקרדיוגרפיה (ECG), ניטור גלגל פעילות (AWM) וניתוחים ביוכימיים והיסטולוגיים. עכברי LDLR/P-407 הפגינו מאפיינים ייחודיים לאחר ארבעה שבועות, כולל תפקוד לקוי של הדיאסטוליה, מקטע פליטה שמור ועובי מוגבר של דופן החדר השמאלי. יש לציין כי לחץ הדם והתפקוד הכליתי נותרו בטווח התקין. בנוסף, אק"ג ו-AWM חשפו חסימות לב ופעילות מופחתת, בהתאמה. התפקוד הדיאסטולי הידרדר לאחר שמונה שבועות, מלווה בירידה משמעותית בקצב הנשימה. חקירה נוספת של מודל הטיפול הכפול גילתה פיברוזיס מוגבר, יחסי ריאות רטובים/יבשים ויחסי משקל לב/גוף. עכברי LDLR/P-407 הציגו קסנטלזמות, מיימת ואיסכמיה לבבית. באופן מעניין, מקרי מוות פתאומיים התרחשו בין 6 ל -12 שבועות לאחר הטיפול. מודל HFpEF מציע משאב ניסיוני יקר ומבטיח להבהרת המורכבות של תסמונת מטבולית התורמת לתפקוד דיאסטולי בהקשר של HFpEF בתיווך ליפוטוקסיות.
אי ספיקת לב עם מקטע פליטה משומר (HFpEF) מציינת תסמונת קרדיומטבולית המלווה במחלות רקע מרובות ומהווה מעל 50% מכלל מקרי אי ספיקת הלב 1,2. יתר על כן, התדירות של HFpEF עלתה בהתמדה בעשור האחרון3. עם אפשרויות טיפול מוגבלות, HFpEF מייצג את הצורך הרפואי המשמעותי ביותר שלא נענה במחלות לב וכלי דם, בהתחשב בפתופיזיולוגיה רבת הפנים שלו4. לפיכך, קיים צורך דחוף לשפר את ההבנה של המנגנונים הבסיסיים ואת הפתופיזיולוגיה של HFpEF לפתח טיפולים יעילים.
למרות התקדמות משמעותית בשנים האחרונות, הפתופיזיולוגיה של HFpEF המיוחסת לליפוטוקסיות נותרה מובנת לחלוטין. נקבע כי חולים עם HFpEF מפגינים הצטברות שומנים בולטת בשריר הלב בהשוואה לאלה עם אי ספיקת לב עם מקטע פליטה מופחת (HFrEF) וקבוצת ביקורת בריאה5. נתוני ריצוף RNA מביופסיות לב הראו ירידה בוויסות הגן ליפופרוטאין ליפאז (LPL) בקבוצת HFpEF בהשוואה לחולים בריאים וחולי HFrEF6. Poloxamer-407 (P-407) הוא קו-פולימר בלוק הגורם להיפרליפידמיה על ידי חסימת LPL ולאחר מכן הגדלת טריגליצרידים בפלזמה וליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) כולסטרול7. מחקרים קודמים הדגימו ביטוי גבוה של קולטן LDL (LDLR) בליבם של עכברי HFpEF8.
בהתבסס על ממצאים אלה ומתוך הכרה בצורך הדחוף במודלים של בעלי חיים המחקים במדויק HFpEF לבבי-מטבולי, פותח והוצג מודל מורין המושרה על ידי היפרליפידמיה. מודל זה נתפר כדי לחקור את HFpEF, תוך התמקדות מפורשת במעורבות של lipotoxicity לצד תסמונת מטבולית. מודל זה, המושרה על ידי חסימת היפרליפידמיה/LPL וביטוי LDLR לבבי משופר, הוקם בעכברי WT-129 על רקע 129J באמצעות זריקות תוך-פריטוניאליות דו-שבועיות (i.p.) של P-407 בשילוב עם הזרקה תוך ורידית אחת (i.v.) של וירוס 9-טרופונין לבבי הקשור לאדנו T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR)9.
בין 4 ל -8 שבועות לאחר הטיפול, נערך מערך נרחב של הערכות, כולל אקוקרדיוגרפיה, רישומי לחץ דם, פלטיסמוגרפיה של כל הגוף (WBP), טלמטריה אלקטרוקרדיוגרפית רציפה (ECG), ניטור גלגל פעילות (AWM), כמו גם ניתוחים ביוכימיים והיסטולוגיים9. לאחר ארבעה שבועות, עכברי LDLR/P407 או "טיפול כפול" הציגו תכונות HFpEF מובהקות, כולל תפקוד דיאסטולי, מקטע פליטה שמור ועובי מוגבר של דופן החדר השמאלי9. בנוסף, טלמטריית אק"ג ו-AWM חשפו חסימות לב ופעילות מופחתת, בהתאמה. יש לציין כי לחץ הדם והתפקוד הכליתי נותרו תקינים9. לאחר שמונה שבועות, התפקוד הדיאסטולי הידרדר, ומדידות WBP חשפו קצב נשימה מופחת9.
חקירה נוספת של מודל הטיפול הכפול גילתה פיברוזיס, יחס ריאות רטוב/יבש גבוה ויחס משקל לב/גוף9. נקרופסי גילה מיימת, איסכמיה לבבית וקסנטלזמות. באופן מסקרן, מקרי מוות פתאומיים תועדו בין 6 ל-12 שבועות לאחר הטיפול9. מודל HFpEF מונע היפרליפידמיה מורין זה מספק כלי ניסיוני מהיר, בעל ערך ומבטיח לפענוח המורכבות של תסמונת מטבולית התורמת לתפקוד לקוי של דיאסטולי עם HFpEF בתיווך ליפוטוקסיות.
פרוטוקול בעלי החיים אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) באוניברסיטת מיאמי, בהתאם להנחיות המכון הלאומי לבריאות (NIH) (פרוטוקול IACUC 23-103-ad03). במחקר הנוכחי, עכברי בר (WT) על רקע 129J נרכשו ממקור מסחרי (ראו טבלת חומרים) וגודלו בבית. כל העכברים היו המלטות על רקע 129J. הניסויים כללו עכברים זכרים ונקבות. עכבר LDLR/P-407 HFpEF הוקם על ידי מתן מנה אחת של AAV9-cTnT-LDLR בשבוע הראשון ודו-שבועי p407 במשך ארבעה שבועות.
1. הכנה וניהול AAV9-cTnT-LDLR
הערה: פלסמיד AAV9-cTNT-hLDLR (ראו טבלת חומרים) מקודד את חלבון ה-LDLR האנושי המלא (2664bp) (איור 1).
2. הכנת P-407 וניהולו
3. הערכת אקוקרדיוגרפיה
4. הקלטת נתוני לולאת נפח לחץ (PV)
לאחר 4 שבועות של מינון יחיד משולב i.v. AAV9-cTnT-LDLR ו- i.p דו-שבועי. זריקות P-407, אקוקרדיוגרפיה גילתה HFpEF, כפי שמעידים מקטע הפליטה שהשתמר, זמן הרפיה תוך ורידי ממושך (IVRT) ו- E/E' וכן ירידה ב- E/A (איור 3A-E). תפקוד דיאסטולי גרוע יותר נצפה לאחר 8 שבועות בהשוואה לנתונים לאחר 4 שבועות. ניתוח לולאת לחץ-נפח (PV) לאחר 8 שבועות של טיפול הראה שיפוע מוגבר של יחסי לחץ-נפח דיאסטולי, המאשש את ממצאי אקוקרדיוגרפיה של תפקוד דיאסטולי לקוי (איור 3F). יש לציין שמוות פתאומי התרחש במספר משמעותי של עכברים שטופלו ב-LDLR/P-407 בין 6 ל-12 שבועות לאחר הטיפול ב-LDLR/P-407 (איור 3G). תוצאות אלה מצביעות על HFpEF קרדיו-מטבולי, המאשרות את היעילות של פרוטוקול זה ועיצוב ניסוי. היפרליפידמיה נצפתה בעכברים שטופלו ב-LDLR/P407 לאחר 4 ו-8 שבועות, כפי שמעידים רמות כולסטרול כלליות גבוהות, טריגליצרידים, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) ורמות כולסטרול נורמליות של ליפופרוטאין בצפיפות גבוהה, מה שמחזק את הממצאים שלנו לגבי היפרליפידמיה (איור 3H).
איור 1: מפת פלסמיד עבור AAV9-cTnT-LDLR. לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 2: הליכי הזרקה. (A) תמונה מייצגת המדגימה את הזרקת ורידי הזנב תוך ורידי (i.v.) של AAV9-cTnT-LDLR בעכבר WT על רקע זן 129J. (B) איור של הזרקה תוך-צפקית של P-407 בעכבר WT על רקע זן 129J שטופל בעבר במינון i.v. יחיד של AAV9-cTnT-LDLR. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
איור 3: HFpEF לבבי-מטבולי. (A-E) פרמטרים של אקוקרדיוגרפיה המצביעים על אי ספיקת לב עם מקטע פליטה שמור (HFpEF) לאחר 4 (n = 17) ו -8 שבועות (n = 11) של טיפול LDLR/P-407 בהשוואה לעכברים שלא טופלו (n = 15). עדות לכך היא מקטע פליטה שמור, זמן הרפיה איזובולומי ממושך (IVRT), E / E מוגבר ו E / A מופחת, כל האינדיקטורים של תפקוד דיאסטולי. (F) רכישת לולאת נפח לחץ וניתוחים גילו שיפוע מוגבר של יחסי לחץ-נפח דיאסטולי (EDPVR) לאחר 8 שבועות של טיפול. (G) מוות פתאומי התרחש בין 6 ל -12 שבועות לאחר הטיפול ב- LDLR/P-407. (H) פאנל שומנים תמך בממצאים של היפרליפידמיה בעכברים שטופלו ב-LDLR/P407 לאחר 4 (n = 4) ו-8 שבועות (n = 3), כפי שמעידים רמות כולסטרול כלליות גבוהות, טריגליצרידים, ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה מאוד (VLDL), כולסטרול ליפופרוטאין בצפיפות נמוכה (LDL) ורמות כולסטרול ליפופרוטאין נורמליות בצפיפות גבוהה בהשוואה לעכברים שלא טופלו (n = 5). הנתונים מיוצגים כממוצע ± SD. *P < 0.05, **P < 0.01, ***P < 0.001, ****P < 0.0001. אנא לחץ כאן כדי להציג גרסה גדולה יותר של איור זה.
למרות העלייה המתמדת בשכיחות של HFpEF בעשור האחרון, הבנה קונקרטית של הפתופיזיולוגיה הבסיסית נותרה חמקמקה13. יתר על כן, נכון להיום, קיים טיפול מוגבל מבוסס ראיות13. יש צורך בהבנה משופרת של המנגנונים המעורבים ב-HFpEF קרדיו-מטבולי. בעבר הוצג מודל עכבר היפרליפידמי המחקה HFpEF ללא מחלת כליות כרונית (CKD) או יתר לחץ דם הנגרם על ידי זריקות LDLR OE ו-p4079.
הממצאים הראו כי השילוב של LDLR OE לבבי והיפרליפידמיה גורם לתפקוד דיאסטולי, הפרעות קצב, היפרטרופיה של החדר השמאלי (LV), אי סבילות לפעילות גופנית, הצטברות שומנים בלב ופיברוזיס בעכברים לאחר ארבעה שבועות, כפי שפורסם קודם לכן9. כמו כן נצפתה עלייה בספיגת כולסטרול LDL בלב, בכבד ובשרירי השלד וירידה בטריגליצרידים בלב ובכבד של עכברים אלה9. יתרונה של שיטה זו טמון במהירות שלה לחקר מסלולי תסמונת לב-מטבולית, שאינם מובנים היטב בהשוואה למודלים אחרים של עכברי HFpEF היפרליפידמיים, כגון דיאטה עתירת שומן (HFD) הדורשים עד 16 ו -20 שבועות לפתח14. פיתוח מודל זה אורך ארבעה שבועות והוא מחקה הפרעות מטבוליות בבני אדם. לכן, יכולת השחזור של מודל זה היא חיונית.
זה הכרחי כדי להבטיח הכנה יסודית וניהול של AAV9-cTnT-LDLR ו P-407. יכולת השכפול של מודל זה תלויה מאוד בחישובים מדויקים של ריכוזים ומינונים של P-407 ו- AAV9-cTnT- LDLR, כמו גם מדידות משקל. לא פחות חשובים הם תכשירי תמיסה וטכניקות הזרקה תוך ורידית ותוך צפקית נכונות. סטיות בטכניקות אלה עלולות לגרום לשינויים משמעותיים ולתוצאות לא רצויות.
למרות האפקטיביות והיעילות של מודל זה, קיימות מספר מגבלות. יש צורך בהכשרה קפדנית לביצוע זריקות תוך ורידי ותוך צפק. בנוסף, קיים סיכון פוטנציאלי לתחלואה ולתמותה הקשורים לזריקות תוך ורידי ותכופות תוך צפקיות. פציעות זנב עכבר עלולות להיגרם בעת ביצוע זריקות תוך ורידי, בעוד ניקוב cecal עלול להתרחש עם זריקות intraperitoneal, המוביל דלקת הצפק15. פציעות אלה נובעות בדרך כלל מטכניקות שגויות ועלולות לגרום לאיבוד נבדקים ניסיוניים וטיפול. לכן, יש צורך בהכשרה מקיפה לפני ביצוע הליכים אלה. מגבלה נוספת היא המיקוד של דגם זה בזן 129J. הרציונל מאחורי הבחירה בזן 129J נובע ממחקרים ראשוניים שהניבו תפקוד דיאסטולי מהיר יותר וממצאי HFpEF בזן זה בהשוואה לעכברי C57BL/6 שחקרנו בתחילה במחקרים שלא פורסמו.
ללא קשר למגבלות אלה, מודל זה יאפשר חקירות מהירות יותר של המנגנונים הבסיסיים המעורבים ב- HFpEF ואפשרויות טיפול יעילות פוטנציאליות. מחקרים קודמים הובילו לפיתוח מודל פתופיזיולוגי עבור HFD המושרה על ידי HFpEF ו- N[w]-nitro-l-arginine methyl ester (L-NAME) במשך 5-15 שבועות13. עם זאת, בשל העלייה המתמדת בשכיחות של HFpEF, יש צורך דחוף בהבנה נוספת של הפתופיזיולוגיה של HFpEF cardiometabolic ופיתוח טיפול יעיל. מודל מורין זה של LDLR OE לבבי והיפרליפידמיה הנגרמת על ידי p407 הוא שיטה מהירה ואפשרית לגרימת HFpEF קרדיומטבולי למאמצי מחקר עתידיים.
אנו מודים ל-Penncore ול-NHLBI Gene Therapy Resource Program (GTRP) על מימון הדור של הנגיף הקשור לאדנו המשמש בפרויקט זה. מחקר זה מומן על ידי מענקים מהמכון הלאומי לבריאות (NIH) (1R01HL140468) והמכון לחקר הלב במיאמי ל-LS. MW זכתה בפרס תוספת הגיוון של NIH בין השנים 2020 - 2022 (R01HL140468- 03S1). JH ממומן על ידי 1R01 HL13735, 1R01 HL107110, 5UM1 HL113460, 1R01 HL134558, 5R01 CA136387 (מה-NIH), W81XWH-19-PRMRPCTA (ממשרד ההגנה), והקרנות המשפחתיות סטאר, ליפסון וסופר.
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Adeno-associated virus 9-cardiac troponin T-LDLR (AAV9-cTnT-LDLR) | U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP) | Transgene plasmids and AAVs particles were generated by the U. Penn Vector Core, funded by the NHLBI Gene Therapy Program (GTRP). AAV were provided in Dulbecco’s phosphate-buffered saline (PBS) with 0.001% Pluronic F68. The Core determined AAV titers by digital droplet polymerase chain reaction (ddPCR) and assessed all preparations for capsid protein ratio by SDS-PAGE and for the presence of endotoxin. Constructs include the human (h) transcripts tagged by 3X HA, Penn Vector Core (RRID: SCR_022432). AAV9-cTNT-hLDLR plasmid encodes the full human LDLR protein (2664bp). | |
Imaging systems with a high frequency transducer probe MS400 | (VisualSonics, Toronto, ON, Canada) | Vevo 2100 or 3100 | |
Isoflurane | Akorn Animal Health, Inc. | NDC: 59399-106-01 | |
LabChart software | ADInstruments | Pro version 8.1.5 | |
Poloxamer 407 | Sigma-Aldrich | 16758 | |
PV catheter | Millar Instrument | PVR 1035 | |
Ultrasound analysis software | Vevo Lab | ||
Wild-type (WT) mice on 129J background | Jackson Laboratory |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved