A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) הוא חיישן ביולוגי חדשני המאפשר מדידה רציפה של רמות cAMP בתאים חיים. הביוסנסור נוצר מחלבון פלואורסצנטי בעל תמורות מעגליות המקושר לאזור הציר של Epac2. זה יוצר חיישן ביולוגי פלואורופור יחיד המציג פלואורסצנטיות מוגברת או מופחתת בעת קשירת cAMP. הביוסנסור קיים בגרסאות אדומות וירוקות כלפי מעלה, כמו גם בגרסאות ירוקות כלפי מטה, ובמספר גרסאות אדומות וירוקות הממוקדות למיקומים תת-תאיים. כדי להמחיש את יעילותו של הביוסנסור נעשה שימוש בגרסה הירוקה כלפי מטה, אשר פוחתת בפלואורסצנטיות בעת קשירת cAMP. שני פרוטוקולים המשתמשים בחיישן זה מודגמים: האחד משתמש בספקטרופוטומטר קריאת לוחות של 96 בארות התואם לסינון בתפוקה גבוהה והשני באמצעות הדמיה של תא בודד במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקורא הצלחות, תאי HEK-293 שגודלו בתרבית בצלחות 96 בארות עוררו עם 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר איזופרוטרנול, מה שגרם לירידות מהירות וגדולות בפלואורסצנטיות בגרסה הירוקה כלפי מטה. הביוסנסור שימש למדידת רמות cAMP בתאי שריר חלק של דרכי נשימה אנושיות בודדות (HASM) המנוטרות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הביוסנסור הירוק כלפי מטה הראה תגובות דומות לאוכלוסיות של תאים כאשר הוא מגורה באמצעות פורסקולין או איזופרוטרנול. בדיקה חד-תאית זו מאפשרת הדמיה של מיקום הביו-חיישן בהגדלה של פי 20 ו-40. לפיכך, חיישן ביולוגי cAMP זה רגיש וגמיש, ומאפשר מדידה בזמן אמת של cAMP הן בתאים אימורטליים והן בתאים ראשוניים, ועם תאים בודדים או אוכלוסיות של תאים. תכונות אלה הופכות את cADDis לכלי רב ערך לחקר דינמיקת איתות cAMP בתאים חיים.
אדנוזין 3′,5′-מונופוספט מחזורי, cAMP, ממלא תפקיד מרכזי בתקשורת התאית ובתיאום תהליכים פיזיולוגיים שונים. cAMP פועל כשליח שני, ומעביר אותות חיצוניים מהורמונים, מוליכים עצביים או מולקולות חוץ-תאיות אחרות כדי ליזום שרשרת של אירועים תוך-תאיים1. יתר על כן, cAMP מעורב באופן מורכב במסלולי איתות שונים, כולל אלה הקשורים לקולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) וציקלזות אדניליל. הבנת התפקיד של cAMP באיתות תאי היא בסיסית לפענוח המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס תפקודים תאיים נורמליים ופיתוח טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מצבים רפואיים2.
בעבר ננקטו שיטות שונות למדידת cAMP במישרין או בעקיפין. אלה כללו תיוג רדיוא....
הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.
1. בדיקת ספקטרופוטומטר לקריאת לוחות בתפוקה גבוהה
המחקר הנוכחי אימת את הביוסנסור הציטוסולי הן בקורא לוחות והן במבחני מיקרוסקופ. ברגע שהתאים ביטאו את הביו-סנסור, הם עוררו באמצעות 10 מיקרומטר פורסקולין (מפעיל ישיר של ציקלז אדניליל), איזופרוטרנול 10 ננומטר (אגוניסט ב-ß1AR ו-ß2AR), או רכב (איור 1). השינויים הבאים בפלואורס?.......
מדידה מדויקת ורגישה של cAMP חיונית להבנת תפקידו בתהליכים תאיים שונים ולחקר הפעילות של מסלולי איתות תלויי cAMP. ישנן מספר שיטות נפוצות למדידת רמות cAMP, כולל ELISA, radioimmunoassay, חיישנים ביולוגיים של FRET ובדיקת cAMP של GloSensor 14,15,16,17,18.<.......
מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NHLBI) (HL169522).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved