דינמיקת cAMP בזמן אמת בתאים חיים באמצעות גלאי ההבדל cAMP פלואורסצנטי באתרו

Summary

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) הוא חיישן ביולוגי חדשני המאפשר מדידה רציפה של רמות cAMP בתאים חיים. הביוסנסור נוצר מחלבון פלואורסצנטי בעל תמורות מעגליות המקושר לאזור הציר של Epac2. זה יוצר חיישן ביולוגי פלואורופור יחיד המציג פלואורסצנטיות מוגברת או מופחתת בעת קשירת cAMP. הביוסנסור קיים בגרסאות אדומות וירוקות כלפי מעלה, כמו גם בגרסאות ירוקות כלפי מטה, ובמספר גרסאות אדומות וירוקות הממוקדות למיקומים תת-תאיים. כדי להמחיש את יעילותו של הביוסנסור נעשה שימוש בגרסה הירוקה כלפי מטה, אשר פוחתת בפלואורסצנטיות בעת קשירת cAMP. שני פרוטוקולים המשתמשים בחיישן זה מודגמים: האחד משתמש בספקטרופוטומטר קריאת לוחות של 96 בארות התואם לסינון בתפוקה גבוהה והשני באמצעות הדמיה של תא בודד במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקורא הצלחות, תאי HEK-293 שגודלו בתרבית בצלחות 96 בארות עוררו עם 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר איזופרוטרנול, מה שגרם לירידות מהירות וגדולות בפלואורסצנטיות בגרסה הירוקה כלפי מטה. הביוסנסור שימש למדידת רמות cAMP בתאי שריר חלק של דרכי נשימה אנושיות בודדות (HASM) המנוטרות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הביוסנסור הירוק כלפי מטה הראה תגובות דומות לאוכלוסיות של תאים כאשר הוא מגורה באמצעות פורסקולין או איזופרוטרנול. בדיקה חד-תאית זו מאפשרת הדמיה של מיקום הביו-חיישן בהגדלה של פי 20 ו-40. לפיכך, חיישן ביולוגי cAMP זה רגיש וגמיש, ומאפשר מדידה בזמן אמת של cAMP הן בתאים אימורטליים והן בתאים ראשוניים, ועם תאים בודדים או אוכלוסיות של תאים. תכונות אלה הופכות את cADDis לכלי רב ערך לחקר דינמיקת איתות cAMP בתאים חיים.

Introduction

אדנוזין 3′,5′-מונופוספט מחזורי, cAMP, ממלא תפקיד מרכזי בתקשורת התאית ובתיאום תהליכים פיזיולוגיים שונים. cAMP פועל כשליח שני, ומעביר אותות חיצוניים מהורמונים, מוליכים עצביים או מולקולות חוץ-תאיות אחרות כדי ליזום שרשרת של אירועים תוך-תאיים¹. יתר על כן, cAMP מעורב באופן מורכב במסלולי איתות שונים, כולל אלה הקשורים לקולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) וציקלזות אדניליל. הבנת התפקיד של cAMP באיתות תאי היא בסיסית לפענוח המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס תפקודים תאיים נורמליים ופיתוח טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מצבים רפואיים².

בעבר ננקטו שיטות שונות למדידת cAMP במישרין או בעקיפין. אלה כללו תיוג רדיוא....

Protocol

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בדיקת ספקטרופוטומטר לקריאת לוחות בתפוקה גבוהה

1. זריעת תאי HEK-293 עם וקטור cADDis BacMam בצלחת 96 בארות (יום 1)
   1. לפצל ולהדביק תאים במכסה מנוע נגיפי.
      1. חומרי HEK חמים (טבלה 1) ו-0.25% טריפס.......

Discussion

מדידה מדויקת ורגישה של cAMP חיונית להבנת תפקידו בתהליכים תאיים שונים ולחקר הפעילות של מסלולי איתות תלויי cAMP. ישנן מספר שיטות נפוצות למדידת רמות cAMP, כולל ELISA, radioimmunoassay, חיישנים ביולוגיים של FRET ובדיקת cAMP של GloSensor 14,15,16,17,18.^<.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate (clear)	Fisherbrand	21-377-203
35 mm dish	Greiner Bio-One	627870	Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate	Corning	3904	Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscope	Keyence
Calcium chloride (IM)	Quality Biological Inc	E506	For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)	Thermo Scientific	339651
DMEM (1x)	Gibco	11965092	HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+	Gibco	14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+	Corning	14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D systems	S11195	For HEK and HASM media
Forskolin	Millipore	344270	Drug
Green Down cADDis cAMP Assay Kit	Montana Molecular	#D0200G	Reagent
Ham's F-12K	Gibco	21127022	For HASM media
HEPES (1M)	Gibco	15630080	For HASM media
Isoproterenol	Sigma	I6504	Drug
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)	Eppendorf	22363352
Primocin	Invitrogen	ant-pm-1	Antibiotic for HASM media
RNAse away	Thermo Scientific	700511	Reagent
Sodium hydroxide solution	Sigma	S2770	For HASM media
Spectrmax M5 plate reader	Molecular Devices
Trichostatin A	TCI America	T2477	Reagent
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Reagent