Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

הפרוטוקול המוצג במחקר זה ממחיש את יעילותו של cAMP Difference Detector In Situ במדידת cAMP בשתי שיטות. שיטה אחת משתמשת בספקטרופוטומטר קריאת לוחות 96 בארות עם תאי HEK-293. השיטה השנייה מדגימה תאי HASM בודדים תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי.

Abstract

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) הוא חיישן ביולוגי חדשני המאפשר מדידה רציפה של רמות cAMP בתאים חיים. הביוסנסור נוצר מחלבון פלואורסצנטי בעל תמורות מעגליות המקושר לאזור הציר של Epac2. זה יוצר חיישן ביולוגי פלואורופור יחיד המציג פלואורסצנטיות מוגברת או מופחתת בעת קשירת cAMP. הביוסנסור קיים בגרסאות אדומות וירוקות כלפי מעלה, כמו גם בגרסאות ירוקות כלפי מטה, ובמספר גרסאות אדומות וירוקות הממוקדות למיקומים תת-תאיים. כדי להמחיש את יעילותו של הביוסנסור נעשה שימוש בגרסה הירוקה כלפי מטה, אשר פוחתת בפלואורסצנטיות בעת קשירת cAMP. שני פרוטוקולים המשתמשים בחיישן זה מודגמים: האחד משתמש בספקטרופוטומטר קריאת לוחות של 96 בארות התואם לסינון בתפוקה גבוהה והשני באמצעות הדמיה של תא בודד במיקרוסקופ פלואורסצנטי. בקורא הצלחות, תאי HEK-293 שגודלו בתרבית בצלחות 96 בארות עוררו עם 10 מיקרומטר פורסקולין או 10 ננומטר איזופרוטרנול, מה שגרם לירידות מהירות וגדולות בפלואורסצנטיות בגרסה הירוקה כלפי מטה. הביוסנסור שימש למדידת רמות cAMP בתאי שריר חלק של דרכי נשימה אנושיות בודדות (HASM) המנוטרות תחת מיקרוסקופ פלואורסצנטי. הביוסנסור הירוק כלפי מטה הראה תגובות דומות לאוכלוסיות של תאים כאשר הוא מגורה באמצעות פורסקולין או איזופרוטרנול. בדיקה חד-תאית זו מאפשרת הדמיה של מיקום הביו-חיישן בהגדלה של פי 20 ו-40. לפיכך, חיישן ביולוגי cAMP זה רגיש וגמיש, ומאפשר מדידה בזמן אמת של cAMP הן בתאים אימורטליים והן בתאים ראשוניים, ועם תאים בודדים או אוכלוסיות של תאים. תכונות אלה הופכות את cADDis לכלי רב ערך לחקר דינמיקת איתות cAMP בתאים חיים.

Introduction

אדנוזין 3′,5′-מונופוספט מחזורי, cAMP, ממלא תפקיד מרכזי בתקשורת התאית ובתיאום תהליכים פיזיולוגיים שונים. cAMP פועל כשליח שני, ומעביר אותות חיצוניים מהורמונים, מוליכים עצביים או מולקולות חוץ-תאיות אחרות כדי ליזום שרשרת של אירועים תוך-תאיים1. יתר על כן, cAMP מעורב באופן מורכב במסלולי איתות שונים, כולל אלה הקשורים לקולטנים מצומדים לחלבון G (GPCRs) וציקלזות אדניליל. הבנת התפקיד של cAMP באיתות תאי היא בסיסית לפענוח המנגנונים המורכבים העומדים בבסיס תפקודים תאיים נורמליים ופיתוח טיפולים פוטנציאליים למגוון רחב של מצבים רפואיים2.

בעבר ננקטו שיטות שונות למדידת cAMP במישרין או בעקיפין. אלה כללו תיוג רדיוא....

Protocol

הפרטים של כל הריאגנטים והציוד ששימשו למחקר מפורטים בטבלת החומרים.

1. בדיקת ספקטרופוטומטר לקריאת לוחות בתפוקה גבוהה

  1. זריעת תאי HEK-293 עם וקטור cADDis BacMam בצלחת 96 בארות (יום 1)
    1. לפצל ולהדביק תאים במכסה מנוע נגיפי.
      1. חומרי HEK חמים (טבלה 1) ו-0.25% טריפס.......

Representative Results

המחקר הנוכחי אימת את הביוסנסור הציטוסולי הן בקורא לוחות והן במבחני מיקרוסקופ. ברגע שהתאים ביטאו את הביו-סנסור, הם עוררו באמצעות 10 מיקרומטר פורסקולין (מפעיל ישיר של ציקלז אדניליל), איזופרוטרנול 10 ננומטר (אגוניסט ב-ß1AR ו-ß2AR), או רכב (איור 1). השינויים הבאים בפלואורס?.......

Discussion

מדידה מדויקת ורגישה של cAMP חיונית להבנת תפקידו בתהליכים תאיים שונים ולחקר הפעילות של מסלולי איתות תלויי cAMP. ישנן מספר שיטות נפוצות למדידת רמות cAMP, כולל ELISA, radioimmunoassay, חיישנים ביולוגיים של FRET ובדיקת cAMP של GloSensor 14,15,16,17,18.<.......

Acknowledgements

מחקר זה נתמך על ידי המכון הלאומי ללב, ריאות ודם (NHLBI) (HL169522).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate (clear)Fisherbrand21-377-203
35 mm dishGreiner Bio-One627870Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate Corning3904Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscopeKeyence
Calcium chloride (IM)Quality Biological IncE506For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM (1x)Gibco11965092HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+ Gibco14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+Corning14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D systemsS11195For HEK and HASM media
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham's F-12K Gibco21127022For HASM media
HEPES (1M)Gibco15630080For HASM media
IsoproterenolSigmaI6504Drug
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotic for HASM media
RNAse awayThermo Scientific700511Reagent
Sodium hydroxide solutionSigmaS2770For HASM media
Spectrmax M5 plate readerMolecular Devices
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagent
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagent

References

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical me....

Explore More Articles

CAMP BiosensorCADDisEpac2CAMP DynamicsHEK 293HASM96CAMP

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved