Dinâmica de cAMP em tempo real em células vivas usando o detector de diferença de cAMP fluorescente in situ

Summary

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Abstract

O Detector de Diferença de cAMP In Situ (cADDis) é um novo biossensor que permite a medição contínua dos níveis de cAMP em células vivas. O biossensor é criado a partir de uma proteína fluorescente permutada circularmente ligada à região da dobradiça de Epac2. Isso cria um único biossensor de fluoróforo que exibe fluorescência aumentada ou diminuída após a ligação do cAMP. O biossensor existe em versões ascendentes vermelhas e verdes, bem como versões verdes descendentes e várias versões vermelhas e verdes direcionadas a locais subcelulares. Para ilustrar a eficácia do biossensor, foi utilizada a versão verde para baixo, que diminui a fluorescência após a ligação do cAMP. Dois protocolos usando este sensor são demonstrados: um utilizando um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços compatível com triagem de alto rendimento e outro utilizando imagens de célula única em um microscópio fluorescente. No leitor de placas, células HEK-293 cultivadas em placas de 96 poços foram estimuladas com 10 μM de forscolina ou 10 nM de isoproterenol, o que induziu reduções rápidas e grandes na fluorescência na versão verde para baixo. O biossensor foi usado para medir os níveis de cAMP em células individuais do músculo liso das vias aéreas humanas (HASM) monitoradas sob um microscópio fluorescente. O biossensor verde descendente exibiu respostas semelhantes às populações de células quando estimulado com forscolina ou isoproterenol. Este ensaio de célula única permite a visualização da localização do biossensor com ampliação de 20x e 40x. Assim, este biossensor de cAMP é sensível e flexível, permitindo a medição em tempo real de cAMP em células imortalizadas e primárias, e com células únicas ou populações de células. Esses atributos tornam o cADD uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica da sinalização do cAMP em células vivas.

Introduction

A adenosina 3',5'-monofosfato cíclico, cAMP, desempenha um papel central na comunicação celular e na coordenação de vários processos fisiológicos. O AMPc atua como um segundo mensageiro, retransmitindo sinais externos de hormônios, neurotransmissores ou outras moléculas extracelulares para iniciar uma cascata de eventos intracelulares¹. Além disso, o cAMP está intrinsecamente envolvido em várias vias de sinalização, incluindo aquelas associadas a receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e adenilil ciclases. Compreender o papel do AMPc na sinalização celular é fundamental para desvendar os mecanismos complexos subjacentes às funções celulares n....

Protocol

Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Ensaio de alto rendimento do espectrofotômetro de leitura de placas

1. Semeando células HEK-293 com o vetor cADDis BacMam em uma placa de 96 poços (Dia 1)
   1. Dividir e infectar células em um capuz viral.
      1. Meio HEK quente (Tabela 1) e tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria a 37 °C.
      2. Desinfete o capô e .......

Discussion

A medição precisa e sensível do cAMP é crucial para entender seu papel em vários processos celulares e para estudar a atividade das vias de sinalização dependentes do cAMP. Existem vários métodos comumente empregados para medir os níveis de cAMP, incluindo ELISA, radioimunoensaio, biossensores FRET e o ensaio GloSensor cAMP 14,15,16,17,18. Cada ensai.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate (clear)	Fisherbrand	21-377-203
35 mm dish	Greiner Bio-One	627870	Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate	Corning	3904	Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscope	Keyence
Calcium chloride (IM)	Quality Biological Inc	E506	For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)	Thermo Scientific	339651
DMEM (1x)	Gibco	11965092	HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+	Gibco	14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+	Corning	14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D systems	S11195	For HEK and HASM media
Forskolin	Millipore	344270	Drug
Green Down cADDis cAMP Assay Kit	Montana Molecular	#D0200G	Reagent
Ham's F-12K	Gibco	21127022	For HASM media
HEPES (1M)	Gibco	15630080	For HASM media
Isoproterenol	Sigma	I6504	Drug
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)	Eppendorf	22363352
Primocin	Invitrogen	ant-pm-1	Antibiotic for HASM media
RNAse away	Thermo Scientific	700511	Reagent
Sodium hydroxide solution	Sigma	S2770	For HASM media
Spectrmax M5 plate reader	Molecular Devices
Trichostatin A	TCI America	T2477	Reagent
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Reagent