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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

O protocolo apresentado neste estudo ilustra a eficácia do Detector de Diferença de AMPc In Situ na medição do AMPc através de dois métodos. Um método utiliza um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços com células HEK-293. O outro método demonstra células HASM individuais sob um microscópio fluorescente.

Abstract

O Detector de Diferença de cAMP In Situ (cADDis) é um novo biossensor que permite a medição contínua dos níveis de cAMP em células vivas. O biossensor é criado a partir de uma proteína fluorescente permutada circularmente ligada à região da dobradiça de Epac2. Isso cria um único biossensor de fluoróforo que exibe fluorescência aumentada ou diminuída após a ligação do cAMP. O biossensor existe em versões ascendentes vermelhas e verdes, bem como versões verdes descendentes e várias versões vermelhas e verdes direcionadas a locais subcelulares. Para ilustrar a eficácia do biossensor, foi utilizada a versão verde para baixo, que diminui a fluorescência após a ligação do cAMP. Dois protocolos usando este sensor são demonstrados: um utilizando um espectrofotômetro de leitura de placas de 96 poços compatível com triagem de alto rendimento e outro utilizando imagens de célula única em um microscópio fluorescente. No leitor de placas, células HEK-293 cultivadas em placas de 96 poços foram estimuladas com 10 μM de forscolina ou 10 nM de isoproterenol, o que induziu reduções rápidas e grandes na fluorescência na versão verde para baixo. O biossensor foi usado para medir os níveis de cAMP em células individuais do músculo liso das vias aéreas humanas (HASM) monitoradas sob um microscópio fluorescente. O biossensor verde descendente exibiu respostas semelhantes às populações de células quando estimulado com forscolina ou isoproterenol. Este ensaio de célula única permite a visualização da localização do biossensor com ampliação de 20x e 40x. Assim, este biossensor de cAMP é sensível e flexível, permitindo a medição em tempo real de cAMP em células imortalizadas e primárias, e com células únicas ou populações de células. Esses atributos tornam o cADD uma ferramenta valiosa para estudar a dinâmica da sinalização do cAMP em células vivas.

Introduction

A adenosina 3',5'-monofosfato cíclico, cAMP, desempenha um papel central na comunicação celular e na coordenação de vários processos fisiológicos. O AMPc atua como um segundo mensageiro, retransmitindo sinais externos de hormônios, neurotransmissores ou outras moléculas extracelulares para iniciar uma cascata de eventos intracelulares1. Além disso, o cAMP está intrinsecamente envolvido em várias vias de sinalização, incluindo aquelas associadas a receptores acoplados à proteína G (GPCRs) e adenilil ciclases. Compreender o papel do AMPc na sinalização celular é fundamental para desvendar os mecanismos complexos subjacentes às funções celulares n....

Protocol

Os detalhes de todos os reagentes e equipamentos usados para o estudo estão listados na Tabela de Materiais.

1. Ensaio de alto rendimento do espectrofotômetro de leitura de placas

  1. Semeando células HEK-293 com o vetor cADDis BacMam em uma placa de 96 poços (Dia 1)
    1. Dividir e infectar células em um capuz viral.
      1. Meio HEK quente (Tabela 1) e tripsina-EDTA a 0,25% em banho-maria a 37 °C.
      2. Desinfete o capô e .......

Representative Results

O presente estudo validou o biossensor citosólico em ensaios de leitura de placas e microscópio. Uma vez que as células expressaram o biossensor, elas foram estimuladas com 10 μM de forscolina (um ativador direto da adenilil ciclase), 10 nM de isoproterenol (um agonista em ß1AR e ß2AR) ou veículo (Figura 1). As mudanças subsequentes na fluorescência, indicativas da produção de cAMP, foram capturadas a cada 30 s.

Os dados foram tran.......

Discussion

A medição precisa e sensível do cAMP é crucial para entender seu papel em vários processos celulares e para estudar a atividade das vias de sinalização dependentes do cAMP. Existem vários métodos comumente empregados para medir os níveis de cAMP, incluindo ELISA, radioimunoensaio, biossensores FRET e o ensaio GloSensor cAMP 14,15,16,17,18. Cada ensai.......

Acknowledgements

Este estudo foi apoiado pelo Instituto Nacional do Coração, Pulmão e Sangue (NHLBI) (HL169522).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
96-well plate (clear)Fisherbrand21-377-203
35 mm dishGreiner Bio-One627870Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate Corning3904Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)Gibco15240062For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscopeKeyence
Calcium chloride (IM)Quality Biological IncE506For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)Thermo Scientific339651
DMEM (1x)Gibco11965092HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+ Gibco14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+Corning14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)R&D systemsS11195For HEK and HASM media
ForskolinMillipore344270Drug
Green Down cADDis cAMP Assay KitMontana Molecular#D0200GReagent
Ham's F-12K Gibco21127022For HASM media
HEPES (1M)Gibco15630080For HASM media
IsoproterenolSigmaI6504Drug
L-glutamine 200 mM (100x)Gibco25030-081For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)Eppendorf22363352
PrimocinInvitrogenant-pm-1Antibiotic for HASM media
RNAse awayThermo Scientific700511Reagent
Sodium hydroxide solutionSigmaS2770For HASM media
Spectrmax M5 plate readerMolecular Devices
Trichostatin ATCI AmericaT2477Reagent
Trypsin EDTAGibco25200-056Reagent

References

  1. Krishna, G., Weiss, B., Brodie, B. B. A simple, sensitive method for the assay of adenyl cyclase. J Pharmacol Exp Ther. 163 (2), 379-385 (1968).
  2. Post, S. R., Ostrom, R. S., Insel, P. A. Biochemical me....

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