Динамика цАМФ в реальном времени в живых клетках с использованием флуоресцентного дифференциального детектора цАМФ in situ

Summary

Протокол, представленный в этом исследовании, иллюстрирует эффективность дифференциального детектора цАМФ in situ в измерении цАМФ с помощью двух методов. В одном из методов используется 96-луночный планшетный спектрофотометр с ячейками HEK-293. Другой метод демонстрирует отдельные клетки HASM под флуоресцентным микроскопом.

Abstract

cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) — это новый биосенсор, который позволяет непрерывно измерять уровни цАМФ в живых клетках. Биосенсор создается из циркулярно переставленного флуоресцентного белка, связанного с шарнирной областью Epac2. В результате создается один флуорофорный биосенсор, который демонстрирует либо повышенную, либо пониженную флуоресценцию при связывании цАМФ. Биосенсор существует в красной и зеленой версиях вверх, а также в зеленой версии вниз, а также в нескольких красных и зеленых версиях, предназначенных для субклеточных мест. Чтобы проиллюстрировать эффективность биосенсора, была использована зеленая версия вниз, которая снижает флуоресценцию при связывании с цАМФ. Продемонстрированы два протокола с использованием этого датчика: один с использованием 96-луночного спектрофотометра, совместимого с высокопроизводительным скринингом, а другой с использованием визуализации одиночных клеток на флуоресцентном микроскопе. На планшете клетки HEK-293, культивируемые в 96-луночных планшетах, стимулировали 10 мкМ форсколином или 10 нМ изопротеренолом, что вызывало быстрое и значительное снижение флуоресценции в зеленом нисходящем варианте. Биосенсор был использован для измерения уровней цАМФ в отдельных клетках гладких мышц дыхательных путей человека (HASM), контролируемых под флуоресцентным микроскопом. Зеленый направленный вниз биосенсор показал аналогичную реакцию на популяции клеток при стимуляции форсколином или изопротеренолом. Этот анализ одиночных клеток позволяет визуализировать местоположение биосенсора при 20-кратном и 40-кратном увеличении. Таким образом, этот биосенсор цАМФ является чувствительным и гибким, что позволяет измерять цАМФ в режиме реального времени как в иммортализированных и первичных клетках, так и в отдельных клетках или популяциях клеток. Эти характеристики делают cADDs ценным инструментом для изучения динамики передачи сигналов цАМФ в живых клетках.

Introduction

Аденозин-3',5'-циклический монофосфат, цАМФ, играет центральную роль в клеточной коммуникации и координации различных физиологических процессов. цАМФ действует как второй посредник, ретранслируя внешние сигналы от гормонов, нейротрансмиттеров или других внеклеточных молекул, чтобы инициировать каскад внутриклеточных событий¹. Кроме того, цАМФ неразрывно связан с различными сигнальными путями, в том числе связанными с рецепторами, связанными с G-белком (GPCR) и аденилатциклазами. Понимание роли цАМФ в передаче клеточной сигнализации имеет основополагающее значение для разгадки сложных механизмов, лежащих в основе нормальных клеточных функций, и ....

Protocol

Подробная информация обо всех реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.

1. Планшетный спектрофотометр высокопроизводительного анализа

1. Посев клеток HEK-293 вектором cADDis BacMam в 96-луночный планшет (день 1.......

Discussion

Точное и чувствительное измерение цАМФ имеет решающее значение для понимания его роли в различных клеточных процессах и для изучения активности цАМФ-зависимых сигнальных путей. Существует несколько методов, обычно используемых для измерения уровня цАМФ, включая ИФА, радиоиммунный ан.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
96-well plate (clear)	Fisherbrand	21-377-203
35 mm dish	Greiner Bio-One	627870	Cell culture dishes with glass bottom
96-well plate	Corning	3904	Black with clear flat bottom
Antibiotic-Antimycotic (100x)	Gibco	15240062	For HEK and HASM media
BZ-X fluorescence microscope	Keyence
Calcium chloride (IM)	Quality Biological Inc	E506	For HASM media
Centrifuge tube (15 mL)	Thermo Scientific	339651
DMEM (1x)	Gibco	11965092	HEK media
DPBS with Mg2+ and Ca2+	Gibco	14040-133
DPBS without Mg2+ and Ca2+	Corning	14040-133
Fetal Bovine Serum (FBS)	R&D systems	S11195	For HEK and HASM media
Forskolin	Millipore	344270	Drug
Green Down cADDis cAMP Assay Kit	Montana Molecular	#D0200G	Reagent
Ham's F-12K	Gibco	21127022	For HASM media
HEPES (1M)	Gibco	15630080	For HASM media
Isoproterenol	Sigma	I6504	Drug
L-glutamine 200 mM (100x)	Gibco	25030-081	For HASM media
Microcentrifuge tube (2 mL)	Eppendorf	22363352
Primocin	Invitrogen	ant-pm-1	Antibiotic for HASM media
RNAse away	Thermo Scientific	700511	Reagent
Sodium hydroxide solution	Sigma	S2770	For HASM media
Spectrmax M5 plate reader	Molecular Devices
Trichostatin A	TCI America	T2477	Reagent
Trypsin EDTA	Gibco	25200-056	Reagent