A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.
Протокол, представленный в этом исследовании, иллюстрирует эффективность дифференциального детектора цАМФ in situ в измерении цАМФ с помощью двух методов. В одном из методов используется 96-луночный планшетный спектрофотометр с ячейками HEK-293. Другой метод демонстрирует отдельные клетки HASM под флуоресцентным микроскопом.
cAMP Difference Detector In Situ (cADDis) — это новый биосенсор, который позволяет непрерывно измерять уровни цАМФ в живых клетках. Биосенсор создается из циркулярно переставленного флуоресцентного белка, связанного с шарнирной областью Epac2. В результате создается один флуорофорный биосенсор, который демонстрирует либо повышенную, либо пониженную флуоресценцию при связывании цАМФ. Биосенсор существует в красной и зеленой версиях вверх, а также в зеленой версии вниз, а также в нескольких красных и зеленых версиях, предназначенных для субклеточных мест. Чтобы проиллюстрировать эффективность биосенсора, была использована зеленая версия вниз, которая снижает флуоресценцию при связывании с цАМФ. Продемонстрированы два протокола с использованием этого датчика: один с использованием 96-луночного спектрофотометра, совместимого с высокопроизводительным скринингом, а другой с использованием визуализации одиночных клеток на флуоресцентном микроскопе. На планшете клетки HEK-293, культивируемые в 96-луночных планшетах, стимулировали 10 мкМ форсколином или 10 нМ изопротеренолом, что вызывало быстрое и значительное снижение флуоресценции в зеленом нисходящем варианте. Биосенсор был использован для измерения уровней цАМФ в отдельных клетках гладких мышц дыхательных путей человека (HASM), контролируемых под флуоресцентным микроскопом. Зеленый направленный вниз биосенсор показал аналогичную реакцию на популяции клеток при стимуляции форсколином или изопротеренолом. Этот анализ одиночных клеток позволяет визуализировать местоположение биосенсора при 20-кратном и 40-кратном увеличении. Таким образом, этот биосенсор цАМФ является чувствительным и гибким, что позволяет измерять цАМФ в режиме реального времени как в иммортализированных и первичных клетках, так и в отдельных клетках или популяциях клеток. Эти характеристики делают cADDs ценным инструментом для изучения динамики передачи сигналов цАМФ в живых клетках.
Аденозин-3',5'-циклический монофосфат, цАМФ, играет центральную роль в клеточной коммуникации и координации различных физиологических процессов. цАМФ действует как второй посредник, ретранслируя внешние сигналы от гормонов, нейротрансмиттеров или других внеклеточных молекул, чтобы инициировать каскад внутриклеточных событий1. Кроме того, цАМФ неразрывно связан с различными сигнальными путями, в том числе связанными с рецепторами, связанными с G-белком (GPCR) и аденилатциклазами. Понимание роли цАМФ в передаче клеточной сигнализации имеет основополагающее значение для разгадки сложных механизмов, лежащих в основе нормальных клеточных функций, и ....
Подробная информация обо всех реактивах и оборудовании, использованных для исследования, приведена в Таблице материалов.
1. Планшетный спектрофотометр высокопроизводительного анализа
В настоящем исследовании цитозольный биосенсор был валидирован как в тестах планшетов, так и в анализах микроскопа. После того, как клетки экспрессировали биосенсор, их стимулировали либо 10 мкМ форсколином (прямым активатором аденилатциклазы), 10 нМ изопротеренолом (агонистом при ß1
Точное и чувствительное измерение цАМФ имеет решающее значение для понимания его роли в различных клеточных процессах и для изучения активности цАМФ-зависимых сигнальных путей. Существует несколько методов, обычно используемых для измерения уровня цАМФ, включая ИФА, радиоиммунный ан.......
Это исследование было поддержано Национальным институтом сердца, легких и крови (NHLBI) (HL169522).
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
96-well plate (clear) | Fisherbrand | 21-377-203 | |
35 mm dish | Greiner Bio-One | 627870 | Cell culture dishes with glass bottom |
96-well plate | Corning | 3904 | Black with clear flat bottom |
Antibiotic-Antimycotic (100x) | Gibco | 15240062 | For HEK and HASM media |
BZ-X fluorescence microscope | Keyence | ||
Calcium chloride (IM) | Quality Biological Inc | E506 | For HASM media |
Centrifuge tube (15 mL) | Thermo Scientific | 339651 | |
DMEM (1x) | Gibco | 11965092 | HEK media |
DPBS with Mg2+ and Ca2+ | Gibco | 14040-133 | |
DPBS without Mg2+ and Ca2+ | Corning | 14040-133 | |
Fetal Bovine Serum (FBS) | R&D systems | S11195 | For HEK and HASM media |
Forskolin | Millipore | 344270 | Drug |
Green Down cADDis cAMP Assay Kit | Montana Molecular | #D0200G | Reagent |
Ham's F-12K | Gibco | 21127022 | For HASM media |
HEPES (1M) | Gibco | 15630080 | For HASM media |
Isoproterenol | Sigma | I6504 | Drug |
L-glutamine 200 mM (100x) | Gibco | 25030-081 | For HASM media |
Microcentrifuge tube (2 mL) | Eppendorf | 22363352 | |
Primocin | Invitrogen | ant-pm-1 | Antibiotic for HASM media |
RNAse away | Thermo Scientific | 700511 | Reagent |
Sodium hydroxide solution | Sigma | S2770 | For HASM media |
Spectrmax M5 plate reader | Molecular Devices | ||
Trichostatin A | TCI America | T2477 | Reagent |
Trypsin EDTA | Gibco | 25200-056 | Reagent |
Explore More Articles
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved