בידוד מהיר של ביציות שלב I בדגי זברה נטולי תאי גרנולוזה

Summary

פרוטוקול זה מתאר הליך שונה לבידוד מהיר של ביציות נקיות בשלב I בדגי זברה נטולות תאי גרנולוסה, ובכך מספק שיטה נוחה למחקר ספציפי לביציות.

Abstract

לחקר התפתחות הביציות השלכות משמעותיות בביולוגיה התפתחותית. דג הזברה (Danio rerio) נמצא בשימוש נרחב כאורגניזם מודל לחקר תהליכים התפתחותיים מוקדמים מביצית לעובר. בדגי זברה, הביציות מוקפות בשכבה אחת של תאי גרנולוזה סומטיים. עם זאת, הפרדת תאי גרנולוזה מביציות מציבה אתגר, שכן השגת ביציות טהורות חיונית לניתוח מדויק. למרות שהוצעו שיטות שונות לבידוד ביציות דגי זברה בשלבים התפתחותיים שונים, הטכניקות הנוכחיות אינן מצליחות להסיר תאי גרנולוזה לחלוטין, ומגבילות את הדיוק של ניתוח גנום המתמקד בביציות בלבד. במחקר זה פיתחנו בהצלחה תהליך מהיר ויעיל לבידוד ביציות טהורות בשלב I בדגי זברה תוך סילוק זיהום תאי גרנולוזה. טכניקה זו מאפשרת אנליזה ביוכימית ומולקולרית, במיוחד בחקר היבטים אפיגנטיים ומבנה גנומי ספציפיים לביציות. יש לציין כי השיטה ידידותית למשתמש, ממזערת את נזקי הביציות ומספקת פתרון מעשי למחקר וניתוח בהמשך.

Introduction

דג הזברה הוא בין מערכות המודל החשובות ביותר בביולוגיה התפתחותית. בשנים האחרונות, מחקרים רבים השתמשו בדגי הזברה כמודל לחקר אירועים ביולוגיים חשובים ותהליכי בקרה מביצית לעובר. אלה כוללים את התהליכים המורכבים של התפתחות והבשלת ביציות¹, הפונקציונליות של גנים אימהיים², ויסות מעברים אימהיים-זיגוטיים³, וניתוחי אומיקס נרחבים⁴.

תאי גרנולוסה, התאים הסומטיים העוטפים ומזינים את הביצית המתפתחת בתוך זקיק השחלה ^5,6, ממלאים תפקיד מרכזי בתהליך התפתחותי זה. כאשר תאי נבט קד....

Protocol

כל דגי הזברה טופלו בהתאם להנחיות מחמירות לטיפול בבעלי חיים שהותוו על ידי הגופים הלאומיים ו/או המקומיים הרלוונטיים לרווחת בעלי חיים. התחזוקה והטיפול בדגים קיבלו אישור הן מהרשויות המקומיות והן מוועדת האתיקה של בעלי חיים בבית החולים מערב סין באוניברסיטת סצ'ואן (אישור מס' 20.......

Discussion

במחקר זה פיתחנו שיטה לבידוד ביציות טהורות ונקיות בשלב I, למעט תאי גרנולוסה, לצורך אנליזה במורד הזרם (במיוחד אנליזות גנומיות). בהשוואה בין שיטה שונה זו לשיטה¹³ הנזכרת, הביציות בשלב I המתקבלות בשיטה זו שלמות מורפולוגית, מספיקות במספרן וללא זיהום עם תאים סומטיים ?.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00