Быстрое выделение ооцитов I стадии у рыбок данио-рерио, лишенных гранулезных клеток

Summary

Этот протокол описывает модифицированную процедуру быстрого выделения чистых ооцитов стадии I у рыбок данио, лишенных гранулезных клеток, тем самым обеспечивая удобный метод для исследования, специфичного для ооцитов.

Abstract

Изучение развития ооцитов имеет важное значение для биологии развития. Данио рерио (Danio rerio) широко использовалась в качестве модельного организма для исследования ранних процессов развития от ооцита до эмбриона. У рыбок данио ооциты окружены одним слоем соматических гранулезных клеток. Тем не менее, отделение гранулезных клеток от ооцитов представляет собой сложную задачу, поскольку получение чистых ооцитов имеет решающее значение для точного анализа. Несмотря на то, что были предложены различные методы выделения ооцитов данио-рерио на разных стадиях развития, современные методы не позволяют полностью удалить гранулезные клетки, что ограничивает точность анализа генома, сосредоточенного исключительно на ооцитах. В этом исследовании мы успешно разработали быстрый и эффективный процесс выделения чистых ооцитов I стадии у рыбок данио-рерио с одновременным устранением загрязнения гранулезных клеток. Этот метод облегчает биохимический и молекулярный анализ, особенно при изучении эпигенетических аспектов и структуры генома, специфичных для ооцитов. Примечательно, что метод удобен в использовании, сводит к минимуму повреждение ооцитов и обеспечивает практическое решение для последующих исследований и анализов.

Introduction

Рыбки данио рерио являются одной из наиболее важных модельных систем в биологии развития. В последние годы в многочисленных исследованиях рыбки данио использовались в качестве модели для изучения важных биологических событий и регуляторных процессов от ооцита до эмбриона. Они охватывают сложные процессы развития и^{созревания} ооцитов1, функциональность материнских^генов2, регуляцию материнско-зиготических^{переходов3}, а также обширный омиксный^{анализ4.}

Гранулезные клетки, соматические клетки, обволакивающие и питающие ....

Protocol

Все рыбки данио содержались в соответствии со строгими рекомендациями по уходу за животными, изложенными соответствующими национальными и/или местными органами защиты животных. Содержание и обращение с рыбой получило одобрение как местных властей, так и комитета по.......

Discussion

В этом исследовании мы разработали метод выделения чистых и чистых ооцитов I стадии, за исключением гранулезных клеток, для последующего анализа (в частности, геномного анализа). Сравнивая этот модифицированный метод с упомянутым методом¹³, можно отметить.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kinger's cell dissociation solution	PlantChemMed	PC-33689	Kinger's cell dissociation solution can be stored stably at -20 °C after packaging and can be used after thawing at low temperature (4 °C). It can be used directly for dissociating zebrafish ovaries. The optimal temperature is 28.5 °C, for approximately 2-3 hours. The duration can be adjusted according to the specific dissociation conditions, either shortened or extended (https://www.plantchemmed.com/chanpin?productNo=PC-33689).
Cell strainers (100 μm )	Falcon	352360
Fluorescence microscope	Zeiss	Axio Zoom.V16
Forceps	Dumont	#5
Glass capillary needle	/	/	Blunted by burning with lighter
Hoechst	Yesen	40732ES03
Low adsorption pipette tips (10 μl )	Labsellect	T-0010-LR-R-S
Leibovitz’s L-15 medium medium (with L-glutamine)	Hyclone	SH30525.01
Ice bucket	/	/	Ice-cold water is used to euthanize zebrafish
Incubator	WIGGENS	WH-01
Juvenile fish	/	/	5–6 weeks post-fertilization, standard length [SL] of 10–15 mm
Plastic dish (35 mm )	SORFA	230101
Stereomicroscope	Motic	SMZ-161
Tissue Culture Plate (6-wells)	SORFA	0110006
Vannas spring scissors	Fine Science Toosl	#15000-00