תרבית תרחיף ייצור וטיהור של וירוס הקשור לאדנו על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול עבור יישומי in vivo

Summary

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-10¹² חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

Abstract

פרוטוקול זה מתאר ייצור וטיהור רקומביננטי של וירוס הקשור באדנו (rAAV) על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול, שיטה אגנוסטית לסרוטיפ לטיהור AAV שתוארה לראשונה בשנת 1999. וקטורי rAAV נמצאים בשימוש נרחב ביישומי ריפוי גנטי כדי להעביר טרנסגנים לסוגי תאים אנושיים שונים. בעבודה זו, הנגיף הרקומביננטי מיוצר על ידי טרנספקציה של תאי Expi293 בתרבית תרחיף עם פלסמידים המקודדים את הגנים הטרנסגנים, קפסיד וקטורי ועוזר אדנו-ויראלי. צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול מטהרת חלקיקי AAV מלאים בהתבסס על צפיפות החלקיקים. בנוסף, שלושה שלבים כלולים במתודולוגיה זו הנפוצה כיום על מנת להגדיל את תפוקת הנגיף הכוללת, להפחית את הסיכון למשקעים עקב חלבונים מזהמים, ולרכז עוד יותר את תוצר הנגיף הסופי, בהתאמה: משקעים של חלקיקים נגיפיים ממדיה תאית באמצעות תמיסה של פוליאתילן גליקול (PEG) ונתרן כלורי, הכנסת סבב שני של צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול, והחלפת חיץ באמצעות מסנן צנטריפוגלי. באמצעות שיטה זו, ניתן להשיג באופן עקבי טיטרים בטווח של 10¹² חלקיקים נגיפיים / מ"ל של טוהר יוצא דופן לשימוש in vivo .

Introduction

וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) הם כלים בשימוש נרחב לטיפול במחלות גנטיות, כולל ניוון שרירים בעמוד השדרה, ניוון רשתית והמופיליה A ^1,2,3. וקטורי rAAV מהונדסים כך שיחסרו גנים נגיפיים הנמצאים ב-AAV⁴ מסוג פראי, נגיף איקוסהדרלי קטן שאינו מעטפה עם גנום DNA ליניארי חד-גדילי של 4.7 קילו-בתים. AAV התגלה לראשונה בשנות ה-60 של המאה ה-20 כמזהם של תכשירי אדנו-וירוס⁵. למרות גודל הקפסיד הקטן שלו, המגביל את גודל הטרנסגן שניתן לארוז למקסימום של 4.9 קילו-בתים למעט ITRs⁶, AAV שימושי להעברת טרנסגנים מכיוון ש....

Protocol

הרכב התמיסות והמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מובא בטבלה 1.

תמיסה	הרכב
חיץ ליזיס AAV	1.2 מ"ל של תמיסת NaCl 5 M
	2 מ"ל של 1 M Tris-HCl pH 8.5 פתרון
	80 uL של.......

Discussion

פרוטוקול טיהור שיפוע צפיפות יודיקסנול כפול הוא השיטה האוניברסלית מכיוון שהוא ישים לכל וריאנטים מוטנטיים AAV, ללא קשר לספציפיות הקולטן שלהם. שיטות מוקדמות לטיהור AAV הסתמכו על צפיפות חלקיקים וכללו צנטריפוגה איזופיקנית ב-CsCl וצנטריפוגה הדרגתית רציפה של צפיפות סוכרוז¹⁹. מאוחר יותר.......

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
5810 R benchtop centrifuge	Eppendorf	22625501
8-channel peristaltic pump	Watson-Marlow	020.3708.00A
Automated cell counter	NanoEntek	EVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifuge	Beckman Coulter	369001
Benzonase	Thermo Scientific	88701
Biological safety cabinet	Labconco	322491101
CO2 incubator with shaker			Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339652	50 mL
Conical centrifuge tubes	Thermo Scientific	339650	15 mL
Disposable micro-pipets	Fisherbrand	21-164-2G	Capillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)	Sigma-Aldrich	D1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope	Nikon
Expi293 Expression Medium	Gibco	A1435101
Expi293F cells	Gibco	A14527
Filter tips	USA Scientific	1126-7810	1000 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-8810	200 µL
Filter tips	USA Scientific	1120-1810	20 µL
Filter tips	USA Scientific	1121-3810	10 µL
Hypodermic needles	Tyco Healthcare	820112	20 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lid	VWR	10146-184
JS-5.3 rotor	Beckman Coulter	368690
Magnesium chloride solution (1 M)	Millipore Sigma	M1028-100ML
Metal stand and clamp	Fisherbrand	05-769-6Q
Microcentrifuge tubes	Eppendorf	22600028	1.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifuge	Beckman Coulter	A94471
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium	Gibco	31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)	Serumwerk	AXS-1114542	60% iodixanol solution
P1000 Pipet	Gilson	F144059M
P2 Pipet	Gilson	F144054M
P20 Pipet	Gilson	F144056M
P200 Pipet	Gilson	F144058M
Phenol red solution	Sigma-Aldrich	P0290
Phosphate buffered saline (PBS)	Sigma-Aldrich	P4474
Pipet-Aid XP pipette controller	Drummond Scientific	4-000-101
Plasmid pCapsid	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pACGrh74.
Plasmid pHelper	Addgene	112867
Plasmid pTransgene	De novo or Addgene, etc.	N/A	We used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)	Mp Biomedicals	92750049
Polyethylene glycol 8000	Research Products International	P48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)	Polysciences	NC1038561	Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	431123	500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterile	Corning	430776	250 mL
Polypropylene Optiseal tubes	Beckman Coulter	361625
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP250-B	50 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP225-B	25 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP210-B	10 mL
Serological pipettes	Alkali Scientific	SP205-B	5 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV1000	1 L
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV50-0	500 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV250	250 mL
Shaker flasks	Fisherbrand	PBV12-5	125 mL
Sodium chloride solution (5 M)	Fisher Scientific	NC1752640
Sterile syringes	Fisherbrand	14-955-458	5 mL
Syringe filter	Millipore	SLGV013SL	0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)	Kd Medical	RGE3363
Trypan blue solution	Gibco	15250061
Tube rack assembly	Beckman Coulter	361646
Tube spacers (x4)	Beckman Coulter	361669
Tubing for peristaltic pump	Fisher Scientific	14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor	Beckman Coulter	337922
Ultra low temperature freezer			Set at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentrator	Sartorius	VS2041
Water bath			Set at 37 °C