Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

וירוס הקשור באדנו מיוצר בתרבית תאי השעיה ומטוהר על ידי צנטריפוגה הדרגתית בצפיפות יודיקסנול כפולה. צעדים כלולים כדי להגדיל את התפוקה הכוללת של הנגיף, להקטין את הסיכון של משקעים וירוס, ועוד לרכז את המוצר הסופי של הנגיף. הטיטרים הסופיים הצפויים להגיע ל-1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל ומתאימים לשימוש פרה-קליני in vivo .

Abstract

פרוטוקול זה מתאר ייצור וטיהור רקומביננטי של וירוס הקשור באדנו (rAAV) על ידי צנטריפוגת שיפוע צפיפות יודיקסנול, שיטה אגנוסטית לסרוטיפ לטיהור AAV שתוארה לראשונה בשנת 1999. וקטורי rAAV נמצאים בשימוש נרחב ביישומי ריפוי גנטי כדי להעביר טרנסגנים לסוגי תאים אנושיים שונים. בעבודה זו, הנגיף הרקומביננטי מיוצר על ידי טרנספקציה של תאי Expi293 בתרבית תרחיף עם פלסמידים המקודדים את הגנים הטרנסגנים, קפסיד וקטורי ועוזר אדנו-ויראלי. צנטריפוגת צפיפות יודיקסנול מטהרת חלקיקי AAV מלאים בהתבסס על צפיפות החלקיקים. בנוסף, שלושה שלבים כלולים במתודולוגיה זו הנפוצה כיום על מנת להגדיל את תפוקת הנגיף הכוללת, להפחית את הסיכון למשקעים עקב חלבונים מזהמים, ולרכז עוד יותר את תוצר הנגיף הסופי, בהתאמה: משקעים של חלקיקים נגיפיים ממדיה תאית באמצעות תמיסה של פוליאתילן גליקול (PEG) ונתרן כלורי, הכנסת סבב שני של צנטריפוגה הדרגתית צפיפות יודיקסנול, והחלפת חיץ באמצעות מסנן צנטריפוגלי. באמצעות שיטה זו, ניתן להשיג באופן עקבי טיטרים בטווח של 1012 חלקיקים נגיפיים / מ"ל של טוהר יוצא דופן לשימוש in vivo .

Introduction

וקטורים נגיפיים רקומביננטיים הקשורים באדנו (rAAV) הם כלים בשימוש נרחב לטיפול במחלות גנטיות, כולל ניוון שרירים בעמוד השדרה, ניוון רשתית והמופיליה A 1,2,3. וקטורי rAAV מהונדסים כך שיחסרו גנים נגיפיים הנמצאים ב-AAV4 מסוג פראי, נגיף איקוסהדרלי קטן שאינו מעטפה עם גנום DNA ליניארי חד-גדילי של 4.7 קילו-בתים. AAV התגלה לראשונה בשנות ה-60 של המאה ה-20 כמזהם של תכשירי אדנו-וירוס5. למרות גודל הקפסיד הקטן שלו, המגביל את גודל הטרנסגן שניתן לארוז למקסימום של 4.9 קילו-בתים למעט ITRs6, AAV שימושי להעברת טרנסגנים מכיוון ש....

Protocol

הרכב התמיסות והמאגרים המשמשים בפרוטוקול זה מובא בטבלה 1.

תמיסההרכב
חיץ ליזיס AAV1.2 מ"ל של תמיסת NaCl 5 M
2 מ"ל של 1 M Tris-HCl pH 8.5 פתרון
80 uL של.......

Representative Results

שיטה זו יכולה לשמש להשגת טיטרים של לפחות 1012 חלקיקים נגיפיים לכל מ"ל. ניתן להשיג טיטר (איור 3) באמצעות qPCR באמצעות פריימרים ITR המסופקים בטבלה משלימה 1, באמצעות ddPCR או בכל שיטת טיטרינג אחרת. טיטרים תת-אופטימליים יכולים לנבוע משימוש בגן כובע המקודד לקפסיד עם יע.......

Discussion

פרוטוקול טיהור שיפוע צפיפות יודיקסנול כפול הוא השיטה האוניברסלית מכיוון שהוא ישים לכל וריאנטים מוטנטיים AAV, ללא קשר לספציפיות הקולטן שלהם. שיטות מוקדמות לטיהור AAV הסתמכו על צפיפות חלקיקים וכללו צנטריפוגה איזופיקנית ב-CsCl וצנטריפוגה הדרגתית רציפה של צפיפות סוכרוז19. מאוחר יותר.......

Disclosures

למחברים אין גילויים לדווח.

Acknowledgements

ללא.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5810 R benchtop centrifugeEppendorf22625501
8-channel peristaltic pump Watson-Marlow020.3708.00A
Automated cell counter NanoEntekEVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifugeBeckman Coulter369001
BenzonaseThermo Scientific88701
Biological safety cabinetLabconco322491101
CO2 incubator with shaker Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965250 mL
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965015 mL
Disposable micro-pipetsFisherbrand21-164-2GCapillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)Sigma-AldrichD1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscopeNikon
Expi293 Expression MediumGibcoA1435101
Expi293F cellsGibcoA14527
Filter tipsUSA Scientific1126-78101000 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-8810200 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-181020 µL
Filter tipsUSA Scientific1121-381010 µL
Hypodermic needlesTyco Healthcare82011220 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lidVWR10146-184
JS-5.3 rotorBeckman Coulter368690
Magnesium chloride solution (1 M)Millipore SigmaM1028-100ML
Metal stand and clamp Fisherbrand05-769-6Q
Microcentrifuge tubesEppendorf226000281.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifugeBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Reduced-Serum MediumGibco31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)SerumwerkAXS-111454260% iodixanol solution
P1000 PipetGilsonF144059M
P2 PipetGilsonF144054M
P20 PipetGilsonF144056M
P200 PipetGilsonF144058M
Phenol red solutionSigma-AldrichP0290
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-AldrichP4474
Pipet-Aid XP pipette controllerDrummond Scientific4-000-101
Plasmid pCapsidDe novo or Addgene, etc. N/AWe used pACGrh74. 
Plasmid pHelperAddgene112867
Plasmid pTransgeneDe novo or Addgene, etc. N/AWe used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)Mp Biomedicals92750049
Polyethylene glycol 8000Research Products InternationalP48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)PolysciencesNC1038561Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning431123500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning430776250 mL
Polypropylene Optiseal tubesBeckman Coulter361625
Serological pipettesAlkali ScientificSP250-B50 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP225-B25 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP210-B10 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP205-B5 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV10001 L
Shaker flasksFisherbrandPBV50-0500 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV250250 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV12-5125 mL
Sodium chloride solution (5 M)Fisher ScientificNC1752640
Sterile syringesFisherbrand14-955-4585 mL
Syringe filterMilliporeSLGV013SL0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)Kd MedicalRGE3363
Trypan blue solutionGibco15250061
Tube rack assemblyBeckman Coulter361646
Tube spacers (x4)Beckman Coulter361669
Tubing for peristaltic pumpFisher Scientific14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotorBeckman Coulter337922
Ultra low temperature freezerSet at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentratorSartoriusVS2041
Water bath Set at 37 °C

References

  1. Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
  2. Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved