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O vírus adenoassociado é produzido em cultura de células de suspensão e purificado por centrifugação com duplo gradiente de densidade de iodixanol. Etapas são incluídas para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação do vírus e concentrar ainda mais o produto final do vírus. Os títulos finais esperados atingem 10a 12 partículas virais/mL e são adequados para uso pré-clínico in vivo .
Este protocolo descreve a produção e purificação de vírus adenoassociados recombinantes (rAAV) por centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, um método agnóstico de sorotipo para purificação de AAV descrito pela primeira vez em 1999. Os vetores rAAV são amplamente utilizados em aplicações de terapia gênica para entregar transgenes a vários tipos de células humanas. Neste trabalho, o vírus recombinante é produzido pela transfecção de células Expi293 em cultura de suspensão com plasmídeos que codificam os genes transgene, capsídeo vetorial e adenoviral auxiliar. A centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol purifica partículas completas de AAV com base na densidade de partículas. Além disso, três etapas são incluídas nesta metodologia agora onipresente para aumentar o rendimento total do vírus, diminuir o risco de precipitação devido a proteínas contaminantes e concentrar ainda mais o produto final do vírus, respectivamente: precipitação de partículas virais do meio celular usando uma solução de polietilenoglicol (PEG) e cloreto de sódio, a introdução de uma segunda rodada de centrifugação por gradiente de densidade de iodixanol, e troca de buffer através de filtro centrífugo. Usando este método, é possível obter consistentemente títulos na faixa de 10a 12 partículas virais/mL de pureza excepcional para uso in vivo .
Os vetores virais adenoassociados recombinantes (rAAV) são ferramentas amplamente utilizadas para o tratamento de doenças genéticas, incluindo atrofia muscular espinhal, distrofia retiniana e hemofilia A 1,2,3. Os vetores rAAV são projetados para não ter genes virais presentes no AAV4 selvagem, um vírus icosaédrico pequeno e não envelope com um genoma linear de DNA de fita simples de 4,7 kb. O AAV foi descoberto na década de 1960 como contaminante de preparações de adenovírus5. Apesar de seu pequeno tamanho do capsídeo, que limi....
A composição das soluções e buffers utilizados neste protocolo são apresentados na Tabela 1.
Solução | Composição | |
Tampão de lise AAV | 1,2 mL de solução de NaCl 5 M | |
2 mL de solução 1 M Tris-HCl pH 8,5 | ||
80 uL de solução de 1....... |
Este método pode ser usado para obter títulos de pelo menos10 a 12 partículas virais por mL. Um título pode ser obtido (Figura 3) por qPCR usando os primers ITR fornecidos na Tabela Suplementar 1, por ddPCR ou por qualquer outro método de titulação. Títulos subótimos podem resultar do uso de um gene de tampa que codifica um capsídeo com baixa eficiência de embalagem.
Outra possível fonte de resultados subótimos é .......
O protocolo de purificação com gradiente de densidade de iodixanol duplo é o método universal, pois é aplicável a qualquer variante mutante do AAV, independentemente de sua especificidade receptora. Os primeiros métodos de purificação de AAV baseavam-se na densidade de partículas e incluíam centrifugação isopicnica em CsCl e centrifugação contínua por gradiente de densidade de sacarose19. Posteriormente, foram desenvolvidas abordagens sorotipo-específicas, que utilizaram anticorpo.......
Nenhum.
....Name | Company | Catalog Number | Comments |
5810 R benchtop centrifuge | Eppendorf | 22625501 | |
8-channel peristaltic pump | Watson-Marlow | 020.3708.00A | |
Automated cell counter | NanoEntek | EVE-MC | |
Avanti J-E high-speed centrifuge | Beckman Coulter | 369001 | |
Benzonase | Thermo Scientific | 88701 | |
Biological safety cabinet | Labconco | 322491101 | |
CO2 incubator with shaker | Set at 8% CO2 and 37 °C | ||
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339652 | 50 mL |
Conical centrifuge tubes | Thermo Scientific | 339650 | 15 mL |
Disposable micro-pipets | Fisherbrand | 21-164-2G | Capillaries |
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2 (DPBS) (10x) | Sigma-Aldrich | D1408 | |
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscope | Nikon | ||
Expi293 Expression Medium | Gibco | A1435101 | |
Expi293F cells | Gibco | A14527 | |
Filter tips | USA Scientific | 1126-7810 | 1000 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-8810 | 200 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1120-1810 | 20 µL |
Filter tips | USA Scientific | 1121-3810 | 10 µL |
Hypodermic needles | Tyco Healthcare | 820112 | 20 GA x 1-1/2 A |
Ice bucket with lid | VWR | 10146-184 | |
JS-5.3 rotor | Beckman Coulter | 368690 | |
Magnesium chloride solution (1 M) | Millipore Sigma | M1028-100ML | |
Metal stand and clamp | Fisherbrand | 05-769-6Q | |
Microcentrifuge tubes | Eppendorf | 22600028 | 1.5 mL |
Needle nose pliers | |||
Optima XE-90 ultracentrifuge | Beckman Coulter | A94471 | |
Opti-MEM I Reduced-Serum Medium | Gibco | 31985062 | |
OptiPrep density gradient media (iodixanol) | Serumwerk | AXS-1114542 | 60% iodixanol solution |
P1000 Pipet | Gilson | F144059M | |
P2 Pipet | Gilson | F144054M | |
P20 Pipet | Gilson | F144056M | |
P200 Pipet | Gilson | F144058M | |
Phenol red solution | Sigma-Aldrich | P0290 | |
Phosphate buffered saline (PBS) | Sigma-Aldrich | P4474 | |
Pipet-Aid XP pipette controller | Drummond Scientific | 4-000-101 | |
Plasmid pCapsid | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pACGrh74. |
Plasmid pHelper | Addgene | 112867 | |
Plasmid pTransgene | De novo or Addgene, etc. | N/A | We used pdsAAV-GFP. |
Pluronic F-68 polyol solution (10%) | Mp Biomedicals | 92750049 | |
Polyethylene glycol 8000 | Research Products International | P48080-500.0 | |
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max) | Polysciences | NC1038561 | Dilute in water to 40 μM |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 431123 | 500 mL |
Polypropylene centrifuge tubes, sterile | Corning | 430776 | 250 mL |
Polypropylene Optiseal tubes | Beckman Coulter | 361625 | |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP250-B | 50 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP225-B | 25 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP210-B | 10 mL |
Serological pipettes | Alkali Scientific | SP205-B | 5 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV1000 | 1 L |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV50-0 | 500 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV250 | 250 mL |
Shaker flasks | Fisherbrand | PBV12-5 | 125 mL |
Sodium chloride solution (5 M) | Fisher Scientific | NC1752640 | |
Sterile syringes | Fisherbrand | 14-955-458 | 5 mL |
Syringe filter | Millipore | SLGV013SL | 0.22 micron |
Tris-HCl pH 8.5 (1 M) | Kd Medical | RGE3363 | |
Trypan blue solution | Gibco | 15250061 | |
Tube rack assembly | Beckman Coulter | 361646 | |
Tube spacers (x4) | Beckman Coulter | 361669 | |
Tubing for peristaltic pump | Fisher Scientific | 14190516 | |
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotor | Beckman Coulter | 337922 | |
Ultra low temperature freezer | Set at -70 °C | ||
Vivaspin 20 centrifugal concentrator | Sartorius | VS2041 | |
Water bath | Set at 37 °C |
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