Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Аденоассоциированный вирус получают в культуре суспензионных клеток и очищают центрифугированием с двойным градиентом плотности йодиксанола. Включены шаги по увеличению общего выхода вируса, снижению риска выпадения вируса в осадок и дальнейшей концентрации конечного вирусного продукта. Ожидаемые конечные титры достигают10-12 вирусных частиц/мл и пригодны для доклинического применения in vivo .

Abstract

Этот протокол описывает получение и очистку рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) с помощью центрифугирования с градиентом плотности йодиксанола, серотип-независимого метода очистки AAV, впервые описанного в 1999 году. Векторы rAAV широко используются в генной терапии для доставки трансгенов к различным типам клеток человека. В данной работе рекомбинантный вирус получают путем трансфекции клеток Expi293 в суспензионной культуре с плазмидами, кодирующими трансген, векторный капсид и аденовирусные гены-хелперы. Центрифугирование с градиентом плотности йодиксанола очищает полные частицы AAV на основе плотности частиц. Кроме того, в эту повсеместную методологию включены три этапа для увеличения общего выхода вируса, снижения риска выпадения осадков из-за загрязнения белков и дальнейшей концентрации конечного вирусного продукта, соответственно: осаждение вирусных частиц из клеточных сред с использованием раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) и хлорида натрия, введение второго раунда центрифугирования с градиентом плотности йодиксанола, и замена буфера через центробежный фильтр. Используя этот метод, можно стабильно достигать титров в диапазоне10-12 вирусных частиц/мл исключительной чистоты для использования in vivo .

Introduction

Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) являются широко используемыми инструментами для лечения генетических заболеваний, включая спинальную мышечную атрофию, дистрофию сетчатки и гемофилию А 1,2,3. Векторы rAAV спроектированы таким образом, чтобы не иметь вирусных генов, присутствующих в AAV4 дикого типа, небольшом икосаэдрическом вирусе без оболочки с линейным одноцепочечным геномом ДНК размером 4,7 kb. AAV был впервые обнаружен в 1960-х годах в качестве контаминанта аденовирусных препаратов5. Несмотря на н....

Protocol

Состав растворов и буферов, используемых в данном протоколе, представлен в таблице 1.

РешениеСостав
Буфер для лизиса AAV1,2 мл 5 М раствора NaCl
2 мл 1 М.......

Representative Results

Этот метод может быть использован для получения титров не менее10-12 вирусных частиц на мл. Титр может быть получен (Рисунок 3) методом кПЦР с использованием праймеров ITR, приведенных в Дополнительной таблице 1, методом ddPCR или любым другим методом титрования........

Discussion

Протокол очистки с двойным градиентом плотности йодиксанола является универсальным методом, поскольку он применим к любым мутантным вариантам AAV, независимо от их рецепторной специфичности. Ранние методы очистки AAV основывались на плотности частиц и включали изопикническое центрифу?.......

Acknowledgements

Никакой.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5810 R benchtop centrifugeEppendorf22625501
8-channel peristaltic pump Watson-Marlow020.3708.00A
Automated cell counter NanoEntekEVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifugeBeckman Coulter369001
BenzonaseThermo Scientific88701
Biological safety cabinetLabconco322491101
CO2 incubator with shaker Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965250 mL
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965015 mL
Disposable micro-pipetsFisherbrand21-164-2GCapillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)Sigma-AldrichD1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscopeNikon
Expi293 Expression MediumGibcoA1435101
Expi293F cellsGibcoA14527
Filter tipsUSA Scientific1126-78101000 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-8810200 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-181020 µL
Filter tipsUSA Scientific1121-381010 µL
Hypodermic needlesTyco Healthcare82011220 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lidVWR10146-184
JS-5.3 rotorBeckman Coulter368690
Magnesium chloride solution (1 M)Millipore SigmaM1028-100ML
Metal stand and clamp Fisherbrand05-769-6Q
Microcentrifuge tubesEppendorf226000281.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifugeBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Reduced-Serum MediumGibco31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)SerumwerkAXS-111454260% iodixanol solution
P1000 PipetGilsonF144059M
P2 PipetGilsonF144054M
P20 PipetGilsonF144056M
P200 PipetGilsonF144058M
Phenol red solutionSigma-AldrichP0290
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-AldrichP4474
Pipet-Aid XP pipette controllerDrummond Scientific4-000-101
Plasmid pCapsidDe novo or Addgene, etc. N/AWe used pACGrh74. 
Plasmid pHelperAddgene112867
Plasmid pTransgeneDe novo or Addgene, etc. N/AWe used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)Mp Biomedicals92750049
Polyethylene glycol 8000Research Products InternationalP48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)PolysciencesNC1038561Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning431123500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning430776250 mL
Polypropylene Optiseal tubesBeckman Coulter361625
Serological pipettesAlkali ScientificSP250-B50 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP225-B25 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP210-B10 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP205-B5 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV10001 L
Shaker flasksFisherbrandPBV50-0500 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV250250 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV12-5125 mL
Sodium chloride solution (5 M)Fisher ScientificNC1752640
Sterile syringesFisherbrand14-955-4585 mL
Syringe filterMilliporeSLGV013SL0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)Kd MedicalRGE3363
Trypan blue solutionGibco15250061
Tube rack assemblyBeckman Coulter361646
Tube spacers (x4)Beckman Coulter361669
Tubing for peristaltic pumpFisher Scientific14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotorBeckman Coulter337922
Ultra low temperature freezerSet at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentratorSartoriusVS2041
Water bath Set at 37 °C

References

  1. Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
  2. Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved