Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Аденоассоциированный вирус получают в культуре суспензионных клеток и очищают центрифугированием с двойным градиентом плотности йодиксанола. Включены шаги по увеличению общего выхода вируса, снижению риска выпадения вируса в осадок и дальнейшей концентрации конечного вирусного продукта. Ожидаемые конечные титры достигают10-12 вирусных частиц/мл и пригодны для доклинического применения in vivo .

Abstract

Этот протокол описывает получение и очистку рекомбинантного аденоассоциированного вируса (rAAV) с помощью центрифугирования с градиентом плотности йодиксанола, серотип-независимого метода очистки AAV, впервые описанного в 1999 году. Векторы rAAV широко используются в генной терапии для доставки трансгенов к различным типам клеток человека. В данной работе рекомбинантный вирус получают путем трансфекции клеток Expi293 в суспензионной культуре с плазмидами, кодирующими трансген, векторный капсид и аденовирусные гены-хелперы. Центрифугирование с градиентом плотности йодиксанола очищает полные частицы AAV на основе плотности частиц. Кроме того, в эту повсеместную методологию включены три этапа для увеличения общего выхода вируса, снижения риска выпадения осадков из-за загрязнения белков и дальнейшей концентрации конечного вирусного продукта, соответственно: осаждение вирусных частиц из клеточных сред с использованием раствора полиэтиленгликоля (ПЭГ) и хлорида натрия, введение второго раунда центрифугирования с градиентом плотности йодиксанола, и замена буфера через центробежный фильтр. Используя этот метод, можно стабильно достигать титров в диапазоне10-12 вирусных частиц/мл исключительной чистоты для использования in vivo .

Introduction

Рекомбинантные аденоассоциированные вирусные векторы (rAAV) являются широко используемыми инструментами для лечения генетических заболеваний, включая спинальную мышечную атрофию, дистрофию сетчатки и гемофилию А 1,2,3. Векторы rAAV спроектированы таким образом, чтобы не иметь вирусных генов, присутствующих в AAV4 дикого типа, небольшом икосаэдрическом вирусе без оболочки с линейным одноцепочечным геномом ДНК размером 4,7 kb. AAV был впервые обнаружен в 1960-х годах в качестве контаминанта аденовирусных препаратов5. Несмотря на н....

Protocol

Состав растворов и буферов, используемых в данном протоколе, представлен в таблице 1.

РешениеСостав
Буфер для лизиса AAV1,2 мл 5 М раствора NaCl
2 мл 1 М.......

Representative Results

Этот метод может быть использован для получения титров не менее10-12 вирусных частиц на мл. Титр может быть получен (Рисунок 3) методом кПЦР с использованием праймеров ITR, приведенных в Дополнительной таблице 1, методом ddPCR или любым другим методом титрования........

Discussion

Протокол очистки с двойным градиентом плотности йодиксанола является универсальным методом, поскольку он применим к любым мутантным вариантам AAV, независимо от их рецепторной специфичности. Ранние методы очистки AAV основывались на плотности частиц и включали изопикническое центрифу?.......

Disclosures

Авторы не раскрывают информацию, о которой они могли бы сообщить.

Acknowledgements

Никакой.

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
5810 R benchtop centrifugeEppendorf22625501
8-channel peristaltic pump Watson-Marlow020.3708.00A
Automated cell counter NanoEntekEVE-MC
Avanti J-E high-speed centrifugeBeckman Coulter369001
BenzonaseThermo Scientific88701
Biological safety cabinetLabconco322491101
CO2 incubator with shaker Set at 8% CO2 and 37 °C
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965250 mL
Conical centrifuge tubesThermo Scientific33965015 mL
Disposable micro-pipetsFisherbrand21-164-2GCapillaries
Dulbecco's phosphate buffered saline without CaCl2 and MgCl2  (DPBS) (10x)Sigma-AldrichD1408
ECLIPSE Ts2R-FL inverted microscopeNikon
Expi293 Expression MediumGibcoA1435101
Expi293F cellsGibcoA14527
Filter tipsUSA Scientific1126-78101000 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-8810200 µL
Filter tipsUSA Scientific1120-181020 µL
Filter tipsUSA Scientific1121-381010 µL
Hypodermic needlesTyco Healthcare82011220 GA x 1-1/2 A
Ice bucket with lidVWR10146-184
JS-5.3 rotorBeckman Coulter368690
Magnesium chloride solution (1 M)Millipore SigmaM1028-100ML
Metal stand and clamp Fisherbrand05-769-6Q
Microcentrifuge tubesEppendorf226000281.5 mL
Needle nose pliers
Optima XE-90 ultracentrifugeBeckman CoulterA94471
Opti-MEM I Reduced-Serum MediumGibco31985062
OptiPrep density gradient media (iodixanol)SerumwerkAXS-111454260% iodixanol solution
P1000 PipetGilsonF144059M
P2 PipetGilsonF144054M
P20 PipetGilsonF144056M
P200 PipetGilsonF144058M
Phenol red solutionSigma-AldrichP0290
Phosphate buffered saline (PBS)Sigma-AldrichP4474
Pipet-Aid XP pipette controllerDrummond Scientific4-000-101
Plasmid pCapsidDe novo or Addgene, etc. N/AWe used pACGrh74. 
Plasmid pHelperAddgene112867
Plasmid pTransgeneDe novo or Addgene, etc. N/AWe used pdsAAV-GFP.
Pluronic F-68 polyol solution (10%)Mp Biomedicals92750049
Polyethylene glycol 8000Research Products InternationalP48080-500.0
Polyethylenimine HCl Max (PEI-Max)PolysciencesNC1038561Dilute in water to 40 μM
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning431123500 mL
Polypropylene centrifuge tubes, sterileCorning430776250 mL
Polypropylene Optiseal tubesBeckman Coulter361625
Serological pipettesAlkali ScientificSP250-B50 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP225-B25 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP210-B10 mL
Serological pipettesAlkali ScientificSP205-B5 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV10001 L
Shaker flasksFisherbrandPBV50-0500 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV250250 mL
Shaker flasksFisherbrandPBV12-5125 mL
Sodium chloride solution (5 M)Fisher ScientificNC1752640
Sterile syringesFisherbrand14-955-4585 mL
Syringe filterMilliporeSLGV013SL0.22 micron
Tris-HCl pH 8.5 (1 M)Kd MedicalRGE3363
Trypan blue solutionGibco15250061
Tube rack assemblyBeckman Coulter361646
Tube spacers (x4)Beckman Coulter361669
Tubing for peristaltic pumpFisher Scientific14190516
Type 70 Ti fixed-angle titanium rotorBeckman Coulter337922
Ultra low temperature freezerSet at -70 °C
Vivaspin 20 centrifugal concentratorSartoriusVS2041
Water bath Set at 37 °C

References

  1. Strauss, K. A., et al. Onasemnogene abeparvovec for presymptomatic infants with three copies of SMN2 at risk for spinal muscular atrophy: the Phase III SPR1NT trial. Nat Med. 28 (7), 1390-1397 (2022).
  2. Fuller-Carter, P. I., Basiri, H., Harvey, A. R., Carvalho, L. S.

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

JoVE204

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved