Sign In

A subscription to JoVE is required to view this content. Sign in or start your free trial.

In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.

Abstract

ריפוי גנטי הוא טכנולוגיה רבת עוצמה כדי לספק גנים חדשים לחולה לטיפול במחלה, בין אם זה להחדיר גן פונקציונלי, להשבית גן רעיל, או לספק גן שהתוצר שלו יכול לווסת את הביולוגיה של המחלה. שיטת המסירה של הווקטור הטיפולי יכולה ללבוש צורות רבות, החל מעירוי תוך ורידי למסירה מערכתית ועד הזרקה ישירה לרקמת המטרה. עבור הפרעות נוירודגנרטיביות, לעתים קרובות רצוי להטות את הטרנסדוקציה לכיוון המוח ו / או חוט השדרה. הגישה הכי פחות פולשנית למיקוד מערכת העצבים המרכזית כולה כוללת הזרקה לנוזל השדרה (CSF), מה שמאפשר לטיפול להגיע לחלק גדול ממערכת העצבים המרכזית. הגישה הבטוחה ביותר להעברת וקטור לתוך CSF היא הזרקה intrathecal מותני, שבו מחט מוחדרת לתוך בור מותני של חוט השדרה. טכניקה זו, הידועה גם בשם ניקור מותני, נמצאת בשימוש נרחב במכרסמים יילודים ובוגרים ובמודלים של בעלי חיים גדולים. בעוד שהטכניקה דומה בין מינים ושלבי התפתחות, הבדלים עדינים בגודל, במבנה ובגמישות של רקמות המקיפות את החלל התוך-תאי דורשים התאמות בגישה. מאמר זה מתאר שיטה לביצוע ניקור מותני בחולדות צעירות כדי לספק וקטור סרוטיפ 9 הקשור לאדנו. כאן, 25-35 μL של וקטור הוזרקו לתוך הבור המותני, וכתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שימש כדי להעריך את פרופיל ההתמרה כתוצאה מכל זריקה. היתרונות והאתגרים של גישה זו נדונים.

Introduction

ההבטחה של טיפולים גנטיים בתיווך ויראלי סוף סוף התגשמה בשנים האחרונות עם אישור ה- FDA לטיפולים לאטרופיה של שרירי עמוד השדרה, ניוון רשתית, המופיליה פקטור IX, סרטן ועוד 1,2,3,4. אינספור טיפולים אחרים נמצאים כעת בפיתוח. ריפוי גנטי נועד להעביר גן טיפולי לתאי המטופל. תוצרי הגן החדש יכולים להחליף את הפעילות החסרה בגן אנדוגני לקוי, לעכב גן רעיל, להרוג תאים סרטניים או לספק תפקוד מועיל אחר.

עבור מחלות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS), העברת וקטור הטיפול הגנטי ישירות לרקמת המטרה היא לעתים קרובות רצויה. גישות לא מערכתיו....

Protocol

מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אמורי (IACUC). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות ספראג-דולי (גיל 28-30 יום, מסה בטווח של כ-90-135 גרם, זכרים ונקבות).

1. הכנת הווקטור

  1. הפשירו את וקטור AAV9 (ראו טבלת חומרים) על קרח בתחילת ההליך.
  2. .......

Representative Results

כדי לקבוע את הדיוק של טכניקת ההזרקה, צבע, טריפאן כחול, שימש כפונדקאית לטיפול. צבע זה נקשר בקלות לחלבונים, כך שהוא בדרך כלל נשאר בתוך המבנה שלתוכו הוא הוזרק. משמעות הדבר היא שהצבע עשוי שלא לחזות במדויק את התפלגות הטיפול לאחר ההזרקה; הוא משמש פשוט כדי לחשוף את הדיוק של ההזרקה. כאשר הוא מוכנס בה?.......

Discussion

מגוון רחב של מחלות משפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מתן עותק פונקציונלי של הגן הרלוונטי באמצעות וקטור נגיפי היא אסטרטגיית טיפול אטרקטיבית עבור אלה שהם רצסיביים ומונוגניים בטבע, כגון ניוון שרירים בעמוד השדרה. עם זאת, מחסום הדם-מוח (BBB) אינו כולל את רוב וקטורי הריפוי הגנטי הניתנים תוך ורידי

Disclosures

ד"ר דונסנטה הוא ממציא פטנט תלוי ועומד בנוגע לניהול CSF של וקטורי AAV9.

Acknowledgements

המחברים רוצים להודות לסטיבן גריי, מתיו ריו, ננדה רגמי ולייסי סטרמן מ-UT Southwestern על דיון פורה באתגר שמציבות חולדות צעירות להזרקה תוך-תאית. עבודה זו נתמכה חלקית על ידי מימון של יגואר תרפיה גנטית (ל JLFK).

....

Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
200 µL filtered pipette tipsMidSciPR-200RK-FLPipetting virus
AAV9-GFPVector BuilderP200624-1005ynrAAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 BraidedMcKessonJ422HSuture
Bench padVWR56616-031Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''Fisher Scientific50-195-4664Maintains body temperature
BuprenorphineMcKesson1013922Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)ZoopharmaExtended-release analgesic
Cotton swabsFisher Scientific19-365-409Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive FenestrationSteris1212CPSTFSurgical drape
Dumont #5 ForcepsFine Science Tools11251-20Forceps
Electric BlanketCVS HealthCVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µLEppendorf3123000055Pipetting virus
Fine ScissorsFine Science Tools14059-11Curved surgical scissors
Friedman-Pearson RongeursFine Science Tools16121-14Laminectomy
Halsey Needle HoldersFine Science Tools12001-13Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/ccBD328431Syringe
IsofluraneMcKesson803250Anesthetic
Isopropanol wipesFisher Scientific22-031-350Skin disinfection
Lidocaine, 1%McKesson239935Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mLFisher Scientific05-408-137Loading the syringe
Povidone-iodineFisher Scientific50-118-0481Skin disinfection
Scalpel Handle - #4Fine Science Tools10004-13Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction ChamberBraintree ScientificEZ-17Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually WrappedMcKesson4-111#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye OintmentAlconEye ointment
Trypan BlueVWR97063-702Injection

References

  1. Wurster, C., Petri, S. Progress in spinal muscular atrophy research. Curr Opin Neurol. 35 (5), 693-698 (2022).
  2. Wu, K. Y., et al. Retinitis pigmentosa: Novel therapeutic targets and drug development. Pharm....

Reprints and Permissions

Request permission to reuse the text or figures of this JoVE article

Request Permission

Explore More Articles

This article has been published

Video Coming Soon

JoVE Logo

Privacy

Terms of Use

Policies

Research

Education

ABOUT JoVE

Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved