משלוח וקטורי תוך-תאי בחולדות צעירות באמצעות הזרקת בור מים מותני

Summary

מתואר הליך כירורגי לביצוע זריקות לתוך בור המים המותני של החולדה הצעירה. גישה זו שימשה להעברה תוך-תאית של וקטורים של ריפוי גנטי, אך צפוי כי גישה זו תוכל לשמש למגוון טיפולים, כולל תאים ותרופות.

Abstract

ריפוי גנטי הוא טכנולוגיה רבת עוצמה כדי לספק גנים חדשים לחולה לטיפול במחלה, בין אם זה להחדיר גן פונקציונלי, להשבית גן רעיל, או לספק גן שהתוצר שלו יכול לווסת את הביולוגיה של המחלה. שיטת המסירה של הווקטור הטיפולי יכולה ללבוש צורות רבות, החל מעירוי תוך ורידי למסירה מערכתית ועד הזרקה ישירה לרקמת המטרה. עבור הפרעות נוירודגנרטיביות, לעתים קרובות רצוי להטות את הטרנסדוקציה לכיוון המוח ו / או חוט השדרה. הגישה הכי פחות פולשנית למיקוד מערכת העצבים המרכזית כולה כוללת הזרקה לנוזל השדרה (CSF), מה שמאפשר לטיפול להגיע לחלק גדול ממערכת העצבים המרכזית. הגישה הבטוחה ביותר להעברת וקטור לתוך CSF היא הזרקה intrathecal מותני, שבו מחט מוחדרת לתוך בור מותני של חוט השדרה. טכניקה זו, הידועה גם בשם ניקור מותני, נמצאת בשימוש נרחב במכרסמים יילודים ובוגרים ובמודלים של בעלי חיים גדולים. בעוד שהטכניקה דומה בין מינים ושלבי התפתחות, הבדלים עדינים בגודל, במבנה ובגמישות של רקמות המקיפות את החלל התוך-תאי דורשים התאמות בגישה. מאמר זה מתאר שיטה לביצוע ניקור מותני בחולדות צעירות כדי לספק וקטור סרוטיפ 9 הקשור לאדנו. כאן, 25-35 μL של וקטור הוזרקו לתוך הבור המותני, וכתב חלבון פלואורסצנטי ירוק (GFP) שימש כדי להעריך את פרופיל ההתמרה כתוצאה מכל זריקה. היתרונות והאתגרים של גישה זו נדונים.

Introduction

ההבטחה של טיפולים גנטיים בתיווך ויראלי סוף סוף התגשמה בשנים האחרונות עם אישור ה- FDA לטיפולים לאטרופיה של שרירי עמוד השדרה, ניוון רשתית, המופיליה פקטור IX, סרטן ועוד 1,2,3,4. אינספור טיפולים אחרים נמצאים כעת בפיתוח. ריפוי גנטי נועד להעביר גן טיפולי לתאי המטופל. תוצרי הגן החדש יכולים להחליף את הפעילות החסרה בגן אנדוגני לקוי, לעכב גן רעיל, להרוג תאים סרטניים או לספק תפקוד מועיל אחר.

עבור מחלות המשפיעות על מערכת העצבים המרכזית (CNS), העברת וקטור הטיפול הגנטי ישירות לרקמת המטרה היא לעתים קרובות רצויה. גישות לא מערכתיו....

Protocol

מחקר זה אושר על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים באוניברסיטת אמורי (IACUC). במחקר הנוכחי נעשה שימוש בחולדות ספראג-דולי (גיל 28-30 יום, מסה בטווח של כ-90-135 גרם, זכרים ונקבות).

1. הכנת הווקטור

1. הפשירו את וקטור AAV9 (ראו טבלת חומרים) על קרח בתחילת ההליך.
.......

Discussion

מגוון רחב של מחלות משפיעות על מערכת העצבים המרכזית. מתן עותק פונקציונלי של הגן הרלוונטי באמצעות וקטור נגיפי היא אסטרטגיית טיפול אטרקטיבית עבור אלה שהם רצסיביים ומונוגניים בטבע, כגון ניוון שרירים בעמוד השדרה. עם זאת, מחסום הדם-מוח (BBB) אינו כולל את רוב וקטורי הריפוי הגנטי הניתנים תוך ורידי

Materials

Name	Company	Catalog Number	Comments
200 µL filtered pipette tips	MidSci	PR-200RK-FL	Pipetting virus
AAV9-GFP	Vector Builder	P200624-1005ynr	AAV9 vector expressing GFP
Absorbable Suture with Needle Coated Vicryl Polyglactin 910 FS-2 3/8 Circle Reverse Cutting Needle Size 4 - 0 Braided	McKesson	J422H	Suture
Bench pad	VWR	56616-031	Surgery
Braintree Scientific Isothermal Pads, 8'' x 8''	Fisher Scientific	50-195-4664	Maintains body temperature
Buprenorphine	McKesson	1013922	Analgesic
Buprenorphine-ER (1 mg/mL)	Zoopharma		Extended-release analgesic
Cotton swabs	Fisher Scientific	19-365-409	Blood removal
Drape, Mouse, Clear Plastic, 12" x 12", with Adhesive Fenestration	Steris	1212CPSTF	Surgical drape
Dumont #5 Forceps	Fine Science Tools	11251-20	Forceps
Electric Blanket	CVS Health		CVS Health Series 500 Extra Long Heating Pad
Eppendorf Research plus, 1-channel pipette, variable, 20–200 µL	Eppendorf	3123000055	Pipetting virus
Fine Scissors	Fine Science Tools	14059-11	Curved surgical scissors
Friedman-Pearson Rongeurs	Fine Science Tools	16121-14	Laminectomy
Halsey Needle Holders	Fine Science Tools	12001-13	Needle driver
Insulin Syringes with Ultra-Fine Needle 12.7 mm x 30 G 3/10 mL/cc	BD	328431	Syringe
Isoflurane	McKesson	803250	Anesthetic
Isopropanol wipes	Fisher Scientific	22-031-350	Skin disinfection
Lidocaine, 1%	McKesson	239935	Local anesthesia
Microcentrifuge Tubes: 1.5mL	Fisher Scientific	05-408-137	Loading the syringe
Povidone-iodine	Fisher Scientific	50-118-0481	Skin disinfection
Scalpel Handle - #4	Fine Science Tools	10004-13	Scalpel blade holder
Sure-Seal Induction Chamber	Braintree Scientific	EZ-17	Anesthesia box
Surgical Blade Miltex Carbon Steel No. 11 Sterile Disposable Individually Wrapped	McKesson	4-111	#11 Scalpel blade
SYSTANE NIGHTTIME Eye Ointment	Alcon		Eye ointment
Trypan Blue	VWR	97063-702	Injection