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In This Article

  • Summary
  • Abstract
  • Introduction
  • Protocol
  • Representative Results
  • Discussion
  • Disclosures
  • Acknowledgements
  • Materials
  • References
  • Reprints and Permissions

Summary

Este protocolo oferece uma estrutura sistemática para o estabelecimento de organoides de câncer de ovário de diferentes estágios da doença e aborda os desafios da variabilidade específica da paciente para aumentar o rendimento e permitir uma expansão robusta a longo prazo para aplicações subsequentes. Inclui etapas detalhadas para processamento de tecidos, semeadura, ajuste dos requisitos de meios e coloração por imunofluorescência.

Abstract

Embora o estabelecimento de um biobanco de câncer de ovário a partir de organoides derivados de pacientes, juntamente com suas informações de antecedentes clínicos, prometa avanços na pesquisa e no cuidado ao paciente, a padronização permanece um desafio devido à heterogeneidade dessa malignidade letal, combinada com a complexidade inerente da tecnologia organoide. Este protocolo adaptável fornece uma estrutura sistemática para realizar todo o potencial dos organoides do câncer de ovário, considerando uma variabilidade paciente-específica de progenitores. Ao implementar um fluxo de trabalho experimental estruturado para selecionar condições ideais de cultura e métodos de semeadura, com testes paralelos de semeadura 3D direta versus uma rota 2D/3D, obtemos, na maioria dos casos, linhas de expansão robustas de longo prazo adequadas para uma ampla gama de aplicações downstream.

Notavelmente, o protocolo tem sido testado e se mostrado eficiente em um grande número de casos (N = 120) de material de partida altamente heterogêneo, incluindo câncer de ovário de alto e baixo grau e estádios da doença com debulking primário, doença recorrente e espécimes cirúrgicos pós-neoadjuvantes. Dentro de um ambiente de sinalização exógena de baixo Wnt e alto BMP, observamos progenitores sendo diferentemente suscetíveis à ativação da via da Heregulina 1 ß (HERß-1), com o HERß-1 promovendo a formação de organoides em alguns enquanto o inibe em outros. Para um subconjunto das amostras do paciente, a formação ideal de organoides e o crescimento a longo prazo requerem a adição do fator de crescimento de fibroblastos 10 e R-Spondin 1 ao meio.

Além disso, destacamos as etapas críticas da digestão do tecido e do isolamento do progenitor e apontamos exemplos em que o breve cultivo em 2D em plástico é benéfico para a subsequente formação de organoides na matriz do Extrato de Membrana Basal tipo 2. Em geral, o biobanco ideal requer testes sistemáticos de todas as principais condições em paralelo para identificar um ambiente de crescimento adequado para linhas individuais. O protocolo também descreve o procedimento de manuseio para incorporação, secção e coloração eficientes para obter imagens de alta resolução de organoides, o que é necessário para uma fenotipagem abrangente.

Introduction

O manejo clínico de pacientes com câncer epitelial de ovário permanece desafiador devido à sua apresentação clínica heterogênea em estágios avançados e altas taxas derecorrência1. Melhorar nossa compreensão do desenvolvimento do câncer de ovário e do comportamento biológico requer abordagens de pesquisa que abordem a variabilidade específica do paciente durante o curso da doença, a resposta ao tratamento e as características histopatológicas e moleculares2.

O biobanco, caracterizado pela coleta sistemática e preservação a longo prazo de amostras tumorais derivadas de pacientes com câncer de ov....

Protocol

Espécimes de tecido tumoral de cirurgias de câncer de ovário foram coletados e organoides derivados da paciente foram gerados em conformidade com o Comitê de Ética da Universidade LMU (17-471), aderindo aos regulamentos existentes aplicáveis da UE, nacionais e locais. Cada paciente envolvido no estudo consentiu por escrito. Ao trabalhar com amostras de tecido fresco, a permissão de segurança de Nível 2 de Biossegurança e os gabinetes de fluxo laminar são necessários. Dada a natureza potencialmente infecciosa .......

Representative Results

Após dissociação, filtração e contagem inicial do tecido, as células são semeadas em paralelo diretamente no formato 3D, como explicado acima, bem como a suspensão no frasco para breve expansão 2D. Em alguns casos, a expansão 2D transitória influencia positivamente a formação do organoide, e a linha de longo prazo é estabelecida com sucesso por essa via, enquanto a semeadura 3D paralela comparativa pode resultar em parada de crescimento (Figura 1). Para cada tecido doador proce.......

Discussion

O protocolo projetado aborda os desafios anteriores do biobanco de organoides do câncer de ovário no que diz respeito à formação de organoides e ao potencial de passagem a longo prazo e garante a geração de linhas totalmente expansíveis a partir da maioria dos depósitos tumorais sólidos. O processo de coleta cirúrgica de amostras tumorais a serem utilizadas para geração de organoides impacta significativamente o rendimento e o potencial de expansão. Amostras de tecido tumoral podem ser obtidas durante vári.......

Disclosures

M.K. está listado como um inventor em uma patente relacionada a um meio para organoides de câncer de ovário. F.T. recebeu financiamento de pesquisa, conselho consultivo, honorários e despesas de viagem da AstraZeneca, Clovis, Eisai, ImmunoGen, Medac, MSD, PharmaMar, Roche, SAGA e Tesaro/GSK. S.M. recebeu financiamento de pesquisa, conselho consultivo, honorários ou despesas de viagem: AbbVie, AstraZeneca, Clovis, Eisai, GlaxoSmithKline, Hubro, Medac, MSD, Novartis, Nykode, Olympus, PharmaMar, Pfizer, Roche, Sensor Kinesis, Teva, Tesaro.

Acknowledgements

O estudo é financiado pelo Centro Alemão de Pesquisa do Câncer DKTK, parceiro de Munique, uma parceria entre a DKFZ e o Hospital Universitário LMU de Munique. O estudo também é apoiado pela bolsa alemã Cancer Aid (#70113426 e #70113433). A incorporação de parafina de tecidos e organoides foi realizada nas instalações do núcleo do Instituto de Anatomia, Faculdade de Medicina, LMU Munique, Munique. A Imagem Confocal foi realizada na instalação Core Bioimaging no Centro Biomédico (BMC). Os autores agradecem a Simone Hofmann, Maria Fischer, Cornelia Herbst, Sabine Fink e Martina Rahmeh pela ajuda técnica.

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Materials

NameCompanyCatalog NumberComments
100 Sterican 26 GBraun, Melsungen, Germany4657683
100 Sterican 27 GBraun, Melsungen, Germany4657705
293T HA Rspo1-FcR&D systems, Minneapolis, USA3710-001-01Alternative: R-Spondin1 expressing Cell line, Sigma-Aldrich, SC111
A-83-01 (TGF-b RI Kinase inhibitor IV)Merck, Darmstadt, Germany616454
Advanced DMEM/F-12 Medium Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12634028
Anti-p53 antibody (DO1)Santa Cruz Biotechnology, Texas, USAsc-126
Anti-PAX8 antibodyProteintech, Manchester, UK 10336-1-AP
B-27 Supplement (50x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17504-044
Bottle-top vacuum filter 0.2 µmCorning, Berlin, Germany 430049
CELLSTAR cell culture flask, 175 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria661175
CELLSTAR cell culture flask, 25 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria690160
CELLSTAR cell culture flask, 75 cm2Greiner Bio-one, Kremsmünster, Austria658175
Collagenase IThermo Scientific, Waltham, USA17018029
Costar 48-well Clear TC-treated Corning, Berlin, Germany 3548
Cryo SFMPromoCell – Human Centered Science, Heidelberg, GermanyC-29912
Cultrex Reduced Growth Factor Basement Membrane Extract, Type 2, PathclearR&D systems, Minneapolis, USA3533-005-02Alternative: Matrigel, Growth Factor Reduced Basement membrane matrix  Corning, 356231 
Cy5 AffiniPure Donkey Anti-Mouse IgGJackson Immuno715-175-151
DAKO  Citrate Buffer, pH 6.0, 10x Antigen RetrieverSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyC9999-1000ML
DAPIThermo Scientific, Waltham, USA62248
Donkey anti rabbit Alexa Fluor Plus 555Thermo Scientific, Waltham, USAA32794
Donkey anti-Goat IgG Alexa Fluor Plus 488Thermo Scientific, Waltham, USAA32814
Dulbecco´s Phosphate-Buffered Saline Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA14190-094
Epredia Richard-Allan Scientific HistoGelThermo Scientific, Waltham, USAEpredia HG-4000-012
Falcon 24-well Polystyrene Corning, Berlin, Germany 351447
Feather scalpel Pfm medical, Cologne, Germany200130010
Fetal Bovine SerumGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA10270106
Formalin 37% acid free, stabilizedMorphisto, Offenbach am Main, Germany1019205000
GlutaMAXGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA35050038
HEPES (1 M)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA156630080
Human EpCAM/TROP-1 AntibodyR&D systems, Minneapolis, USAAF960
Human FGF10Peprotech, NJ, USA100-26
Human recombinant BMP2Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHC7146
Human recombinant EGFGibco, Thermo Scientific, Waltham, USAPHG0311L
Human recombinant Heregulin beta-1Peprotech, NJ, USA100-03
LAS X core SoftwareLeica Microsystemshttps://webshare.leica-microsystems.com/latest/core/widefield/
Leica TCS SP8 X White Light Laser Confocal MicroscopeLeica Microsystems
N-2 Supplement (100x)Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA17502-048
NicotinamideSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyN0636
Omnifix 1 mLBraun, Melsungen, Germany3570519
Paraffin
ParafilmOmnilab, Munich, Germany5170002
Paraformaldehyd Morphisto, Offenbach am Main, Germany1176201000
Pen StrepGibco, Thermo Scientific, Waltham, USA15140-122
Penicillin-Streptomycin (10,000 U/mL)Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyP4333-100
PluriStrainer 400 µmPluriSelect, Leipzig, Germany43-50400-01
PrimocinInvivoGen, Toulouse, Franceant-pm-05
Red Blood Cell Lysing BufferSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, Germany11814389001
RoticlearCarl Roth, Karlsruhe, GermanyA538.5
Surgipath ParaplastLeica, Wetzlar, Germany39602012
Thermo Scientific Nunc CryovialsThermo Scientific, Waltham, USA375418PK
Triton X-100Sigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8787
Trypan Blue StainSigma-Aldrich, Merck, Darmstadt, GermanyT8154
TrypLE Express Enzyme Gibco, Thermo Scientific, Waltham, USA12604-013
Tween-20PanReac AppliChem, Darmstadt, GermanyA4974-0100
Y-27632TOCRIS biotechne, Wiesbaden, Germany1254
ZeocinInvitrogen, Thermo Scientific, Waltham, USAR25001

References

  1. Siegel, R. L., Miller, K. D., Fuchs, H. E., Jemal, A. Cancer statistics. CA Cancer J Clin. 72 (1), 7-33 (2022).
  2. Berger, A. C., et al. A comprehensive pan-cancer molecular study of gynecologic and breast cancers. Cancer Cell....

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