В этой статье мы опишем процедуру, которая позволяет обнаруживать патогенные бактерии во время инфекции в масштабах всего органа и количественно оценивать активность флуоресцентных репортеров.
Большинство инфекций происходит в трехмерных тканях хозяина со сложной анатомией и локально изменяющейся физиологией хозяина. Расположение клеток патогена в этой разнообразной среде значительно влияет на уровень их стресса, реакции, судьбу и вклад в общее прогрессирование заболевания и неудачу лечения. Тем не менее, из-за технических трудностей в обнаружении клеток патогена размером мкм в органах-хозяевах, эта область исследований была относительно неизученной. В этой статье мы представляем метод решения этой проблемы. Мы используем серийную двухфотонную томографию и анализ изображений с помощью искусственного интеллекта для обнаружения отдельных клеток сальмонеллы по всей селезенке, долям печени и целым лимфатическим узлам инфицированных мышей. С помощью флуоресцентных репортеров и введения антител in vivo можно определить скорость репликации отдельных клеток сальмонеллы , их местное взаимодействие со специфическими иммунными клетками и бактериальные реакции на антибиотики. Эти методологии открывают возможности для всестороннего изучения инфекций, их профилактики и лечения в трехмерном тканевом контексте.
Инфекции возникают в тканях со сложной анатомией и компартментализированной физиологией. Различные микросреды, которые сосуществуют в инфицированной ткани, могут определять судьбу местных подгрупп патогенов и их вклад в общий исход заболевания 1,2,3. Тем не менее, всестороннее 3D-картирование микробных патогенов в тканях размером в см остается сложной задачей4. Визуализация мозга и других органов является высокоактивной областью исследований с постоянно совершенствующимися экспериментальнымистратегиями, но многим методам все еще не хватает разрешения в пределах менее мкм, которое потребовалось бы для уверенной идентификации бактериальных патогенов размером мкм. В отличие от этого, серийная двухфотонная (STP) томография6 позволяет автоматически получать многоцветную визуализацию целых тканей без деформаций с разрешением менее μм в плоскости, что позволяет получать полные объемные наборы данных. Этот метод сочетает в себе повторное физическое срез ткани с помощью вибратома с прерывистой двухфотонной визуализацией возникающих граней блока инфракрасным светом. STP-томография широко используется для картирования тонких аксонов в мозге для установления карт связей 7,8,9,10.
STP-томография также позволяет 3D-картирование отдельных клеток микробного патогена (сальмонеллы, токсоплазмы) во всех инфицированных тканях11,12 с помощью томографа. Генерация второй гармоники выявляет коллагеновые оболочки вокруг артерий и в фиброзных полосах, таких как трабекулы селезенки, тем самым обеспечивая анатомический контекст. Введенные флуоресцентные антитела in vivo могут быть использованы для окрашивания клеток хозяина, чтобы выявить взаимодействия между отдельными клетками патогена и инфильтрирующими иммунными клетками, такими как нейтрофилы. В данной работе описывается процесс, включающий обработку ткани, визуализацию, сшивание изображений с коррекцией освещенности, наложение изображений в трех измерениях и сегментацию с использованием инструментов машинного обучения. Этот конвейер дает 3D-положение отдельных патогенов, клеток и микроколоний в контексте хозяина. Подсчет количества отдельных клеток в микроколониях остается сложным из-за пределов разрешения, но такие числа могут быть оценены на основе интегрированной яркости микроколонии. Конвейер может быть легко адаптирован к другим моделям инфекции при наличии рекомбинантных GFP- или YFP-экспрессирующих патогенов.
Все описанные здесь эксперименты на животных одобрены государственными органами (лицензия 2239, Kantonales Veterinäramt Basel) и соответствуют местным директивам (Tierschutz-Verordnung, Базель) и швейцарскому закону о защите животных (Tierschutz-Gesetz).
1. Подготовка и хранение инфицированных тканей
2. Встраивание образцов
3. Подготовка микротома и подготовка сцены
4. Выделение поверхности и получение 2D изображений
5. Нахождение краев образцов и установка лазера в начальную точку
6. 3D сканирование / резирование
7. Обработка изображений и анализ данных
Описанная процедура позволяет обнаруживать отдельные клетки сальмонеллы во всех органах мыши, таких как селезенка, печень, брыжеечные лимфатические узлы и пейеровы пятна11 (рис. 5 и рис. 6). Он также обнаруживает паразитов Toxoplasma gondii в мозге мышей12. Некоторые инфицированные ткани, включая печень, пейеровы пятна и селезенку, выделяют значительную автофлуоресценцию в зелено-желтом диапазоне. Автофлуоресценция дополнительно усиливается за счет фиксации параформальдегидом, что необходимо для сохранения структуры ткани. Обнаружение зеленой флуоресценции от GFP, mWasabi и зеленого компонента TIMERbac на этом фоне автофлуоресценции улучшается за счет установки узкополосового фильтра 510/20 нм (пропускающего большую часть излучения GFP, но блокирующего большую часть спектра автофлуоресценции) перед фотоумножителем 2 (который собирает зеленые излучения) и снижением автофлуоресценции тканей путем хранения неподвижных тканей в течение 3 или более дней в криопротекторе11. Тем не менее, бактерии все равно должны экспрессировать, по крайней мере, несколько тысяч копий GFP или других флуоресцентных белков на клетку. С другой стороны, следует избегать чрезмерного уровня флуоресцентного белка, чтобы свести к минимуму затраты на физическую подготовку, которые могут привести к ослаблению вирулентности.
Правильная сегментация флуоресцентных бактерий в тканях может быть подтверждена иммуногистохимическим методом полученных участков тканей после визуализации. В частности, объекты, окрашенные антителом к бактериальным поверхностным компонентам, таким как липополисахарид, могут быть совмещены с флуоресцентным изображением, полученным с помощью STP-томографии (рис. 5). Важно отметить, что у некоторых окрашенных клеток сальмонеллы отсутствуют флуоресцентные белки и, таким образом, обнаруживаемая флуоресценция как при конфокальной микроскопии, так и при STP-томографии. Эти клетки представляют собой сальмонеллы , которые были убиты иммунной системой хозяина, что продемонстрировано проточной цитометрической сортировкой и выращиванием культур из отдельных отсортированных клеток, а также тесной корреляцией между числом колониеобразующих единиц на агаровых планшетах и количеством флуоресцентных клеток сальмонеллы , как определено с помощью проточной цитометрии24. Кроме того, потеря плазмиды может привести к образованию нефлуоресцентных жизнеспособных клеток, и это необходимо проверить путем нанесения на среду с соответствующими антибиотиками и без них, соответствующих маркеру выбора на плазмиде. Для плазмид, полученных из pSC101, потеря плазмид in vivo составляетредкость 19. Для большинства хромосомно интегрированных кассет с экспрессией, таких как sifB::gfp , используемых в11, потеря экспрессии не обнаруживается in vivo. Если сегментация не согласуется с данными иммуногистохимии, конвейер сегментации необходимо модифицировать.
Разрешение STP-томографии недостаточно для разлучения отдельных бактериальных клеток в плотно упакованных микроколониях. Тем не менее, общая интенсивность флуоресценции микроколонии позволяет оценить количество клеток сальмонеллы . Для этого требуется флуоресцентный штамм с высокооднородными уровнями флуоресценции, такой как Salmonella sifB::gfp11. Объединение расчетного количества клеток сальмонеллы для всех микроколоний и отдельных клеток дает общую бактериальную нагрузку на ткани, которая согласуется с альтернативными методами, такими как гальванизация или проточная цитометрия тканевых гомогенатов. Гальваническое покрытие и проточная цитометрия не могут быть выполнены непосредственно из одних и тех же тканей, потому что они должны быть зафиксированы перфузией для STP-томографии. Вместо этого их приходится делать с дополнительными животными, которые не закреплены. Если медиана бактериальной нагрузки, определяемая различными подходами, отличается более чем в 3 раза, жизнеспособность флуоресцентных бактерий может быть нарушена (в случае более низких колониеобразующих единиц) или некоторые бактерии могут потерять флуоресцентную репортерную конструкцию (в случае более высоких колониеобразующих единиц). Для выявления источника таких расхождений потребуется провести контрольный эксперимент.
STP-томография обеспечивает локализацию бактериальных клеток в трехмерной структуре инфицированных тканей. Вторые гармонические сигналы коллагена обеспечивают анатомические ориентиры, такие как артерии и трабекулы. Кроме того, клетки-хозяева могут быть окрашены in vivo путем введения антитела к поверхностным маркерам перед перфузией (рисунок 5 и рисунок 6). Это окрашивание обеспечивает дополнительные ориентиры для тканевых компартментов и специфического микроокружения, включая очаги воспаления (внутриклеточные маркеры и некоторые компартменты с диффузионными барьерами, такие как белая пульпа селезенки или мозг, не являются легкодоступными, подходят для этого окрашивания in vivo). Этот подход показал, что белая пульпа селезенки является тканевым компартментом, обеспечивающим долгосрочную выживаемость сальмонеллы во время антимикробной химиотерапии.
Наконец, сальмонеллы, реплицирующиеся с умеренной или медленной скоростью, могут быть идентифицированы и локализованы в трехмерной структуре тканей с использованием штаммов, экспрессирующих таймерbac, одноклеточный репортер для скорости репликации11,15.
Рисунок 1: Процедура визуализации всего органа с помощью серийной двухфотонной томографии (STP). (A-B) Орган извлекают после транскардиальной перфузии и хранят в течение ночи в 4% параформальдегиде (PFA) при 4 °C. (C-E) Орган погружают в окисленную агарозу и сшивают, затем ткань сканируют и срезают с помощью STP-томографии. Срезы собирают для последующей иммуногистохимии. (Ф-Дж) Конвейеры вычислительного анализа для количественной оценки численности бактерий, подтверждения флуоресцентных бактерий и 3D-реконструкции положения бактерий. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 2: Установка последовательной двухфотонной томографии (STP). (A) Томограф, который включает в себя (B) 2-фотонную визуализацию с (C) автоматизированным последовательным срезом ткани. (D) Собранные срезы тканей для последующих исследований. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 3: Сшивка плитки и коррекция освещенности. Плитка сшивается, а неравномерное освещение корректируется с помощью скорректированного распределения интенсивности с использованием регуляризированной минимизации энергии (CIDRE). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 4: Сегментация сальмонеллы , экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), с помощью метода опорных векторов (SVM) и сверточной нейронной сети (CNN). (A) Репрезентативные изображения объектов GFP, сегментированные SVM (слева) и соответствующие изображения (справа) с областями, сегментированными SVM (масштабная линейка: 10 мкм). (B) Кластеризованное распределение значений красного-зеленого-синего (RGB) для сегментированных областей. (C) Репрезентативные изображения объектов, не относящихся к GFP, ошибочно идентифицированных SVM как бактерии (слева). CNN правильно принимает их за фон (справа, масштабная линейка: 10 мкм). Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 5: Обнаружение сальмонеллы , экспрессирующей зеленый флуоресцентный белок (GFP), с помощью томографии и подтверждения с помощью иммуногистохимии. Снимки того же среза, полученные с помощью томографии (слева) или конфокальной микроскопии после окрашивания антителом к липополисахариду сальмонеллы (справа). Нейтрофилы (красного цвета) окрашивали путем инъекции in vivo меченного ПЭ антитела против Ly-6G перед перфузией. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой цифры.
Рисунок 6: 3D-реконструкция и локализация сальмонеллы в инфицированной селезенке мыши. (A) Трехмерная (3D) реконструкция среза селезенки толщиной 5 мм, окрашенного in vivo до перфузии антителом к CD169 (красным). Синий сигнал представляет собой коллаген, обнаруженный вторыми гармониками. (B) Одна оптическая плоскость 3D-стека, показанного на рисунке (A). Положение клеток сальмонеллы или микроколоний обозначено звездочками. (C) 3D-реконструкция позиций сальмонелл (звездочек) в инфицированной печени. Артерии видны на основе их коллагеновых оболочек (синего цвета). Масштабная линейка: 1 мм. Пожалуйста, нажмите здесь, чтобы просмотреть увеличенную версию этой фигуры.
Локальный тканевый контекст бактериальных патогенов имеет решающее значение для определения локальных атак хозяина, бактериальной адаптации, локального исхода взаимодействия патогена хозяина и антимикробной химиотерапии, а также индивидуального вклада в общий исход заболевания. Визуализация бактерий микрометрового размера в органах размером в сантиметр была сложной задачей. Серийная двухфотонная томография (STP) обеспечивает достаточное пространственное разрешение для обнаружения отдельных бактериальных клеток в целых органах, автоматизированное срезирование и визуализацию, а также достаточную пропускную способность (~1 орган в день)11. В то время как антигены хозяина могут быть окрашены in vivo, клетки патогена должны экспрессировать подходящие флуоресцентные белки для обеспечения всестороннего обнаружения внутриклеточных клеток патогена. Полученные наборы данных (0,5-1,5 терабайта на орган) создают существенные проблемы для ИТ-инфраструктур по анализу и хранению данных.
В этом методе есть несколько важных этапов. Во-первых, требуется штамм патогена с обнаруживаемой и гомогенной экспрессией флуоресцентного белка GFP или YFP. В идеале для минимизации гетерогенности флуоресценции из-за вариации числа копий плазмид используется кассета25 для хромосомной экспрессии. Требуется достаточная интенсивность флуоресценции, но следует избегать чрезмерного уровня флуоресцентного белка, чтобы избежать ухудшения приспособленности патогена23. Соответствующие уровни экспрессии могут быть получены путем выбора соответствующего промотора и тонкой настройки рибосомального сайтасвязывания 25 или всей 5'-нетранслируемой области (UTR)26. Во-вторых, перфузионная фиксация должна включать в себя первоначальную промывку буфером для удаления как можно большего количества эритроцитов из кровообращения. Особенно это критично для селезенки и печени (хотя полное удаление эритроцитов из этих органов затруднено). Оставшиеся эритроциты поглощают свет в видимой части спектра, ухудшая качество изображения27. В-третьих, хранение неподвижных тканей в криопротекторе имеет решающее значение для снижения аутофлуоресценции тканей, которая особенно высока в воспаленных тканях и может затмевать сравнительно слабую флуоресценцию клеток патогена. В-четвертых, эффективная сшивка ткани с окружающим агарозным блоком имеет решающее значение для плавного вибратомного разрезания без выскакивания ткани из агарозного блока. В-пятых, флуоресцентные сигналы и их идентификация в качестве клеток патогена должны быть независимо проверены с использованием ортогональных подходов, таких как окрашивание антителами к компонентам патогена (например, липополисахарид для грамотрицательных бактерий) и конфокальная микроскопия срезов, полученных из томографа11. Некоторые инфицированные ткани содержат автофлуоресцентные частицы с аналогичной формой и перекрывающимися флуоресцентными спектрами, которые могут быть легко ошибочно интерпретированы как клетки патогена. В-шестых, количество клеток патогена в микроколониях следует сравнивать с ортогональными подходами, такими как конфокальная микроскопия, для оценки точности. Общая бактериальная нагрузка на основе этих расчетов должна быть проверена путем сравнения с ортогональными подходами, такими как проточная цитометрия и гальваническое покрытие.
Важными изменениями широко используемого протокола STP являются размещение узкополосового фильтра с длиной волны 510/20 нм перед фотоумножителем 211 для уменьшения интерференции зелено-желтой автофлуоресценции, которая особенно сильна в инфицированной и воспаленной печени, селезенке и пятнах Пейера. Сильная аутофлуоресценция и повышенное рассеяние света в таких органах по сравнению с мозгом (которое доминирует в других приложениях STP) также порождают потребность в более эффективной коррекции неравномерного освещения. В качестве еще одной модификации в этом протоколе используется подход22 CIDRE (рисунок 3) и сегментация бактерий на основе искусственного интеллекта. Наконец, предварительную обработку тканей изменяли путем включения стадии инкубации в криопротектор при -20 °С, что снижает аутофлуоресценцию тканей и, таким образом, облегчает обнаружение мелких клеток патогена с относительно слабой флуоресценцией11.
Устранение неполадок может быть необходимо, если сигналы патогена не могут быть обнаружены или сегментация приводит к недостаточной чувствительности (пропускается слишком много клеток патогена) или недостаточной точности (слишком много фоновых частиц сегментируется как клетки патогена). Если фоновая аутофлуоресценция тканей обнаруживается, но сигналов патогенов слишком мало, патогены могут содержать недостаточное количество флуоресцентных белков. Это может быть проверено с помощью конфокальной микроскопии срезов тканей из той же инфицированной ткани или проточной цитометрии тканевых гомогенатов19,28. Основными причинами могут быть недостаточный уровень сцеживания или нестабильность кассеты для сцеживания. Стратегии смягчения могут включать альтернативные промоторы для стимулирования экспрессии, адаптацию кодонов генов, кодирующих флуоресцентный белок для патогенного вида, использование эписомальных конструкций с более высоким числом копий или стабилизацию экспрессионных кассет путем хромосомной интеграции или сбалансированной летальной комплементации. Выбор флуоресцентного белка также важен, но обнаружение возможно с помощью GFP.mut2, mWasabi, YPet и TIMERbac. Если сегментация неточна, это может быть вызвано слишком слабой флуоресценцией патогена, которую можно было бы решить, как описано выше, или слишком высоким фоном аутофлуоресценции тканей. Обширная перфузия промывочного раствора или длительная инкубация в буфере для хранения непосредственно перед внедрением в агарозный блок и томографию могут решить эти проблемы. Наконец, для точной классификации требуется достаточное обучение нейронной сети, но чрезмерное обучение может привести к переобучению, что ухудшит производительность для новых образцов.
В настоящее время ни один другой метод не может получить изображение целых органов с достаточным пространственным разрешением в 3D для обнаружения отдельных бактерий. Будущие усовершенствования в очистке тканей и микроскопии световых листов могут достичь аналогичного разрешения. Это может обеспечить визуализацию с более высокой скоростью и с большим количеством флуоресцентных каналов.
Важным ограничением STP является разрешение в плоскости ~0,5 мкм и разрешение по вертикали от 5 до 10 мкм, что недостаточно для разрешения близко расположенных бактерий, например, в пределах плотно упакованной микроколонии. Тем не менее, после томографии можно получить срезы тканей для вторичной конфокальной микроскопии выбранных участков ткани с высоким разрешением. Еще одним ограничением STP является наличие только трех флуоресцентных каналов, что ограничивает количество флуорофоров, которые могут быть визуализированы одновременно. Опять же, вторичный анализ полученных срезов ткани с помощью методов мультиплексирования может выявить расположение и интенсивность гораздо большего количества маркеров для выбранных частей ткани. Эта информация может быть интегрирована в общую 3D-структуру окружающей ткани, определенную с помощью STP.
В заключение следует отметить, что этот протокол позволяет проводить детальные исследования взаимодействий хозяина и патогена на локальном и общеорганном уровне. Протокол должен быть легко адаптируемым к другим патогенам (при условии, что они могут быть получены в виде флуоресцентных штаммов), другим органам и различным видам хозяев.
Работа выполнена при поддержке Швейцарского национального научного фонда 310030_156818, 310030_182315 и NCCR_ 180541 AntiResist (to DB).
Name | Company | Catalog Number | Comments |
Chemicals | |||
Agarose Low Melt | Roth | Art. 6351.5 25g | |
Boric acid | Sigma-Aldrich | 6768-500G | |
Instant adhesive Loctite 435 | Henkel | ||
Paraformaldehyde | Sigma-Aldrich | P6148 | |
Poly(ethylene glycol) | Sigma-Aldrich | P5413-1kg | |
Polyvinylpyrrolidone | Sigma-Aldrich | PVP-100G | |
Sodium borohydride | Sigma-Aldrich | 71321-25g | |
Sodium hydroxide | Merck | 106453 | |
Sodium periodate | Sigma-Aldrich | 311448-100G | |
Sodium phosphate dibasic | Sigma-Aldrich | 71640-250G | |
Sodium phosphate monobasic dihydrate | Sigma-Aldrich | 71500-1KG | |
Sodium tetraborate | Sigma-Aldrich | 221732-100g | |
Sucrose | AppliChem | A4734,1000 | |
Tris-buffered saline (TBS) | Merck | T5912-1L | |
Triton X-100 | Sigma-Aldrich | 9002-93-1 | |
Vacuum filtration 500 | TPP | TPP99250 | |
Equipment | |||
Blade | Campden Instruments Limited | 01-01-4692 | |
MAITAI Laser | Spectra-Physics | ||
Peel away plastic mold | Sigma-Aldrich | E6032-1CS | |
TissueCyte 1000 tomograph | TissueVision | ||
Antibody/dyes | |||
DAPI | Merck | D9542-5MG | |
Primary antibodies | |||
anti-LPS Salmonella, rabbit | Sifin | REF TS 1624 | |
anti-CD169-PE, clone 3D6.112 | Biolegend | 142403 | |
anti-Ly-6G-PE, clone 1A8 | Biolegend | 127608 | |
Secondary antibodies | Invitrogen | ||
chicken anti-rabbit Alexa 647 | Invitrogen | A-21443 | |
Software | Company | Version | |
Fiji | Image J | 1.54g or later | |
MATLAB | MathWorks | 2017b/2018b or later | |
Orchestrator (tomograph) | TissueVision | ||
Visualization software Imaris | Oxford Instruments | 9.9.0 or later |
This article has been published
Video Coming Soon
ABOUT JoVE
Copyright © 2025 MyJoVE Corporation. All rights reserved